用于新型冠状病毒检测的核酸等温扩增技术研究进展

核酸检测作为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)筛查诊断和病情监测的主要手段,在疫情防控中发挥了重要作用。虽然实时荧光定量PCR被认为是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的金标准,但其依赖荧光定量PCR仪且扩增检测时间较长,难以实现现场快速检测。因此许多基于核酸等温扩增的SARS-CoV-2检测方法相继诞生。等温扩增对仪器温控要求不高,通过与微流控芯片和可视化检测技术结合,可进一步简化操作、降低成本,为SARS-CoV-2现场快速筛查提供有力的技术支撑。本文围绕已报道的SARS-CoV-2等温扩增检测方法原理、检测性能及优缺点进行探讨,为进一步发展SARS-CoV-2现场快速检测平台提供参考。     

新型冠状病毒荧光定量PCR的Ct值与病毒分离的结果分析

为探究利用SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因作为靶标进行荧光定量检测的Ct值与SARS-CoV-2病毒分离阳性率之间的关系。本研究对广州入境的新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本进行荧光定量PCR检测和用Vero细胞进行病毒分离,统计病毒分离率与荧光定量PCR检测Ct值之间的关系,再通过logistics回归模型用Ct值来预测病毒分离率;同时对收集到的临床样本进行三代测序及进化树的构建。结果显示,在160例新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本中,分离到74株新型冠状病毒,分离阳性率为46.25%,分离到包括20株Alpha、9株Beta、2株Delta等VOC毒株和2株Epsilon、1株Eta等VOI毒株,其他变异株42株;病例样本荧光定量PCR检测ORF1ab基因Ct值为16.12～39.00,N基因的Ct值为17.82～39.41;病毒分离率与样本荧光定量PCR检测的ORF1ab基因和N基因的Ct值均呈负相关,在Ct值>31时,分离率仅9.10%(6/66),而当Ct值<23.1时,病毒分离阳性率可超过95%,分离到新冠病毒的病例样本荧光定量PCR检测的ORF1a...     

新型冠状病毒实验室检测方法研究进展

世界范围内流行的SARS-CoV-2已造成大批新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者,严重威胁着全人类生命健康.新型冠状病毒肺炎尚没有特效药,也没有疫苗,实验室确诊新型冠状病毒肺炎,隔离传染源,尽早治愈患者对整个疫情防控起着非常重要的作用.目前实验室检测方法有病毒分离培养、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、CRISPR/Cas技术、测序技术、基因芯片和抗原抗体检测.本文就上述几种方法做一综述,为确诊COVID-19提供参考.     

肺炎克雷伯菌的芯片式数字PCR检测方法的建立

[背景]条件致病菌肺炎克雷伯菌是医源性感染最重要的革兰氏阴性菌之一,目前对该病原菌的核酸检测方法存在费时费力、灵敏度低、准确性差等问题.[目的]建立基于芯片式数字PCR的肺炎克雷伯菌检测方法.[方法]依据肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过与实时荧光定量PCR的比较分析,确定...     

数字PCR技术及应用研究进展

数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室,PCR扩增反应后,对荧光信号进行检测分析,实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖,具有更高灵敏度和准确度,在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法,并评述该技术在主要应用领域的研究进展。     

基于双重芯片式数字PCR快速鉴定KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的方法

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因bla_KPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因bla_KPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和bla_KPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (bla_KPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有bla_KPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因bla_KPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。     

用于临床新型冠状病毒核酸检测的分子诊断新技术

目前新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)在全球仍呈现大流行趋势,该病潜伏期长、传染性强,给全世界人民的健康安全带来严重威胁。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2)核酸检测作为COVID-19确诊的重要依据之一,在疫情防控工作中发挥了巨大的作用。截至2020年8月17日,国家药品监督管理局已应急批准15个新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其中10个试剂盒是以逆转录-实时荧光定量PCR (RT-qPCR)为主要技术原理,其余试剂盒分别采用了不同于RT-qPCR的5种分子诊断技术。本文对上述检测试剂盒所使用的技术原理、反应时间、优缺点等方面进行了介绍,以期为COVID-19及类似传染病的快速筛查、确诊、防控提供更多的方案思路。     

低拷贝病毒RNA捕获及多重实时荧光定量PCR检测

摘要 目的：为提高COVID-19检测灵敏度,减少新冠患者临床假阴性检测结果,本研究建立了一种SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA捕获方法。方法：利用链霉亲和素磁珠,设计并合成生物素探针捕获SARS-CoV-2假病毒RNA;对磁珠用量、生物素探针浓度和洗脱次数等捕获条件进行了优化;参考WHO发布的序列,针对SARS-CoV-2病毒基因组的ORF1ab 基因和 N 基因序列合成引物和TaqMan探针,对捕获的SARS-CoV-2假病毒RNA进行反转录实时荧光定量PCR检测。采用一步法和分步法检测、单重和多重实时荧光定量PCR检测,并分别比较检测结果。结果：本研究设计的生物素探针能富集到距离探针结合位点至少1.8 K处的序列,在生物素探针浓度12.5 μM,磁珠的工作浓度333.33 μg/mL时,合并RNA的两次洗脱液,对低拷贝病毒RNA的捕获效率最高。研究得到对低拷贝病毒RNA分步法比一步法、多重比单重实时荧光定量PCR检测更灵敏,进行分步法、多重实时荧光定量PCR检测限低于10 copies/μL,组间和重复实验组之间CT值变异系数均小于1%。所有阴性对照样品在检测中均为阴性。结论：本研究优化的链霉亲和素磁珠-生物素探针捕获法是富集SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA的有效方法,其抽提RNA病毒的结果优于一些商业化试剂盒,分步法、多重实时荧光定量PCR对SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA实现了高效检测,这为临床检测低拷贝RNA病毒提供了一种参考方案。     

荧光定量PCR技术及其在科研中的应用

荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术,与常规的PCR相比,荧光定量PCR具有检测灵敏,精确,特异性强,无污染,快速等特点.目前该技术已广泛应用于不同研究的多个领域.主要从荧光定量PCR的基本原理,主要类型和检测应用进行了综述.     

数字PCR定量检测血浆中环状RNA方法的建立

生物标志物一直是医学领域的研究热点.目前主要以实时荧光定量PCR技术作为分子诊断的检测手段,用于大样本的核酸检测,但该技术具有限制性,会导致假阴性.作为第三代PCR的数字PCR技术,优化并提高了检测灵敏度,无需标准曲线实现绝对定量检测,大大提高了检测的精准度,尤其是对于低表达RNA的检测,显得更为出色.本研究以hsa_circ₀061276为例,利用微滴式数字PCR EvaGreen染料法对血浆中hsa_circ₀061276的拷贝数进行绝对定量地检测,成功检测出胃炎和胃癌患者血浆中hsa_circ₀061276的具体拷贝数.因此,数字PCR作为新型检测技术在临床实际应用中有较大推广价值.     

新型冠状病毒纳米PCR快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×10⁴拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。     

血源性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和艾滋病病毒核酸筛查系统的建立与应用

目的：建立同时实现乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）、艾滋病病毒（humanImmunodeficiencyVirus,HIV）检测的多重核酸筛查系统。方法：以HBV、HCV、HIV的保守序列为模板设计特异性引物和探针,通过核酸自动提取系统结合一步法RT-PCR技术平台,优化相关反应体系和条件,建立多重多色实时荧光PCR检测血源性传播病毒的核酸筛查系统。将该系统用于101387例血浆样本的筛查。结果：本研究建立的核酸筛查系统特异性好,HBV灵敏度可以达到20IU／ml,HCV灵敏度可以达到100IU／ml,HIV灵敏度可以达到50IU／mL。结论：本研究建立的核酸筛查系统具有高度自动化、高灵敏度、低成本等特点,适合我国血站系统推广使用。     

新型冠状病毒胶体金抗原快速检测试剂的研制及性能评价*

目的:建立新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)胶体金抗原快速检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,用鼠抗核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)单克隆抗体及二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)作为标记抗体,硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗核衣壳蛋白单克隆抗体和兔抗DNP多抗作为检测线和质控线制备免疫胶体金试纸条;对试剂最低检出限、交叉反应性、加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果:检测热灭活培养物的最低检出限为2.0×10² TCID₅₀/mL;测试16种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应;试剂盒50℃加速破坏8周稳定。临床及健康人群鼻咽拭子样本测试,诊断灵敏度为96.67%(29/30),特异性为99.23%(129/130),总符合率为98.75%(158/160);一致性检验Kappa值为0.959 0,P<0.05。结论:SARS-CoV-2胶体金抗原快速检测试剂检测灵敏度和特异性高,检测速度快,操作便携,无需设备,肉眼观察,可作为现有核酸检测法的补充手段,用于新型冠状病毒的早期筛查。     

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1~2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。     

Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a

The recent outbreak of betacoronavirus Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which is responsible for the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) global pandemic, has created great challenges in viral diagnosis. The existing methods for nucleic acid detection are of high sensitivity and specificity, but the need for complex sample manipulation and expensive machinery slow down the disease detection. Thus, there is an urgent demand to develop a rapid, inexpensive, and sensitive diagnostic test to aid point-of-care viral detection for disease monitoring. In this study, we developed a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR associated proteins (Cas) 12a-based diagnostic method that allows the results to be visualized by the naked eye. We also introduced a rapid sample processing method, and when combined with recombinase polymerase amplification (RPA), the sample to result can be achieved in 50 minutes with high sensitivity (1–10 copies per reaction). This accurate and portable detection method holds a great potential for COVID-19 control, especially in areas where specialized equipment is not available.

The outbreak of SARS-CoV-2 has caused great damage to human society, and early detection of this virus is important to contain its spread and save lives. Existing diagnostic methods are complex and require well-trained personnel, but this study describes a fast and accurate method which can be operated by lay-users and whose results can be visualized by the naked eye.     

H5N1禽流感病毒实验室检测方法灵敏性比较

目的比对实验室常用的H5N1禽流感病毒检测方法灵敏性。方法增殖H5N1病毒,蚀斑技术定量待检病毒,应用细胞接种、血凝实验、RT-PCR、Real-time RT-PCR等方法检测稀释的病毒悬液,比较检测的最低滴度。结果细胞接种、Real-time RT-PCR、RT-PCR及血凝实验能检测病毒的最低滴度为10 PFU/mL、10 PFU/mL、103 PFU/mL及3.52×105 PFU/mL。结论几种检测方法比较而言,细胞接种与Real-time RT-PCR检测灵敏性最高;血凝实验用时最短,但灵敏性低,结果需要进一步确认;RT-PCR用时较较短,检测灵敏性较高。     

PCR相关技术在植物病毒检疫检测中的应用

PCR和建立在PCR基础上的分子生物学技术以其灵敏、快速、简便等优点广泛应用于植物病毒的检测。阐述反转录聚合酶链式反应、免疫捕捉反转录PCR、PCR-单链构型多态性、实时荧光定量PCR、差异显示PCR和巢式PCR等相关技术的原理及其在植物病毒检测中的应用现状,以期为我国植物病毒的检疫检测提供有益参考。