小鼠正常黑色素细胞与黑色素瘤细胞(B16)mRNA表达差异分析

黑色素瘤是一种高侵袭性的恶性皮肤肿瘤,转移率高、预后差。研究黑素瘤细胞生物学特性对黑素瘤的治疗和控制具有重要的意义。本研究以C57BL/6J小鼠的正常黑色素细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象,采用二代测序技术分析两种细胞间的转录组表达差异,筛选差异基因,为后续黑色素瘤的形成机制研究提供理论依据。采用差异倍数及错误率分析测序数据,鉴定出1 436个新的mRNA和4 086个差异表达的已知mRNA。GO数据库和KEGG数据库分析显示,差异表达的mRNAs参与了149个调控途径,主要集中在疾病调控、细胞周期调节和环境信息调控方面。qRT-PCR及Western印迹检测发现,调节细胞增殖、迁移的Pdgf-B、Integrinβ1和Integrinβ5以及调节黑色素颗粒增加的Mitf、Tyr、Tyrp1和Tyrp2在B16细胞中的表达量显著高于在正常黑色素细胞中的表达。本研究获得的差异基因为后续黑色素瘤的研究提供了新的候选基因。     

LncRNA00067110通过靶向Cabyr调控B16-F10细胞增殖、凋亡和黑色素生成

长非编码RNA(lncRNA)是一类转录长度大于200个核苷酸的非编码RNA。现已证明,多个lncRNA是潜在的癌症治疗靶点。LncRNA00067110是从小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和正常黑色素细胞转录物组图谱中发现的差异表达基因。为研究lncRNA00067110是否调控B16-F10细胞的增殖、凋亡和黑色素生成,本文通过LncTar预测和双荧光酶活性验证了钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(Cabyr) 和lncRNA00067110存在靶向关系。通过构建lncRNA00067110的过表达载体,转染B16-F10细胞,经过对B16-F10细胞的转录图谱分析,并对细胞增殖、凋亡和黑色素生成的表型以及相关基因表达变化进行了检测。结果显示,lncRNA00067110靶向Cabyr,在过表达lncRNA00067110的B16细胞中,17个基因呈差异表达。其中,Cabyr的表达被上调,细胞增殖相关基因MEK/ERK/MNK/CREB和黑色素生成相关基因TYR家族成员及CREB的mRNA和蛋白质水平显著被下调,凋亡相关基因AKT和Bcl-2的mRNA水平和蛋白质丰度被上调。进一步通过细胞增殖和凋亡的表型的变化验证了lncRNA00067110的功能。结果提示,lncRNA00067110通过靶向Cabyr,调控相关基因表达,从而抑制B16-F10细胞的增殖和黑色素生成,并诱导黑色素瘤细胞的凋亡,可能成为治疗和抑制黑色素瘤的新的靶点。     

MDCK细胞和MDCK-G1细胞感染H1N1流感病毒后病毒滴度和细胞转录组表达差异分析

目的通过分析细胞表达基因及其相关信号通路的差异等信息,探索MDCK和MDCK-G1细胞株在接种H1N1流感病毒后出现病毒滴度和细胞生长趋势差异的内在生物学特性等原因。方法通过Illumina测序平台对2株细胞进行转录组测序(RNA sequencing, RNA-seq)和测序结果生物信息学分析后,选择了17个差异基因进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)验证。结果 MDCK和MDCK-G1细胞差异基因(differentially expressed genes, DEGs)|log_2(FoldChange)|0和padj≤0.05总数为2 786个。相比于MDCK细胞,MDCK-G1细胞有967个基因的表达显著上升,1 819个基因的表达显著下降。差异基因通过基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集功能注释和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)进行通路分析发现,2株细胞在免疫调控和细胞生长周期调控上均存在差异,qRT-PCR验证的17个基因中有16个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。结论 2株细胞的转录谱存在显著差异。     

小鼠正常黑素细胞和小鼠B16黑素瘤细胞的环状RNAs表达谱

黑素瘤是一种多发于皮肤的恶性肿瘤,因其侵袭性强,预后差等特点一直是科研人员关注的热点。环状RNAs(circRNAs)是一种新型内源性非编码RNA,广泛参与动物生长发育、细胞分化和信号转导等生理过程,但circRNAs在黑素瘤细胞内的分子机制尚未被充分解析。本研究以小鼠(C57BL/6J)正常黑素细胞及B16黑素瘤细胞为研究对象,采用二代测序技术分析两种细胞间circRNAs表达特性。测序结果显示,小鼠正常黑素细胞和黑素瘤细胞中共有851个circRNAs,其中195个差异表达circRNAs(DECs)。GO及KEGG数据库注释发现,DECs的来源基因主要参与细胞周期(cell cycle)、紧密结合(tight junction)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)、TGF-beta信号通路(TGF-beta signaling pathway)等与细胞增殖、迁移相关的信号通路;探究发现,黑素瘤细胞中显著性高表达的circE2F5(circ-3:14578602|14606309)通过上调E2F5的表达促进黑素瘤细胞增殖。circRNA靶基因预测发现,...     

干扰NSUN2通过调控细胞周期蛋白表达抑制黑素瘤细胞增殖

为探讨太阳结构域家族蛋白酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2, Nsun2)RNA甲基化酶在黑素瘤细胞中的生物学功能,本研究以小鼠黑素瘤B16细胞为对象,构建靶向干扰Nsun2基因的shRNA慢病毒干扰载体,包装病毒后感染B16细胞。与对照组相比,干扰组细胞中Nsun2的敲低效率达到80%。EdU染色结果表明,干扰Nsun2显著抑制B16细胞DNA合成能力。转录物组测序技术系统分析干扰组与对照组细胞基因表达水平,共筛选获得1 062个差异表达基因(DEGs),其中678个表达上调,384个表达下调。DEGs主要富集在染色体、着丝粒区、蛋白质结合等GO条目。KEGG分析表明,DEGs显著富集在细胞周期、DNA复制、细胞衰老等通路。荧光定量PCR和转录物组测序结果均发现,Cdk2、Ccna2、Cdc25b等促进细胞分裂的相关基因显著下调,而Gadd45g和Gadd45a等阻滞细胞增殖的基因显著上调。本研究表明,NSUN2通过调控细胞周期和DNA复制等生物学过程,影响黑素瘤细胞增殖,为黑素瘤发生和发展的分子机制研究提供参考。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2（keratin2, Krt2）的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2 基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN 软件比对分析发现,羊驼Krt2 编码序列（cDNA）与NCBI公布的人KRT2高度同源（91%）;将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western 印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸相关蛋白-1（Tyrp1）、小眼畸形相关转录因子（Mitf）基因表达明显上调（P <0.05）;尤其在添加10 ng/mL KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍（P<0.01）,蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍（P<0.01）。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍（P <0.05）、1.8倍（P <0.01）和1.5倍（P <0.05）。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

LncRNA-177922靶向MAPK15调节B16-F10黑色素瘤细胞黑色素生成、增殖、迁移和自噬

黑色素瘤是一种预后较差的侵袭性癌症.了解黑色素瘤的分子机制和诊断标志物对黑色素瘤的防治极为重要.LncRNAs在肿瘤的发生发展中发挥重要作用.与正常黑色素细胞相比,LncRNA-177922在B16-F10黑色素瘤中高表达.丝裂源活化蛋白激酶15 (mitogen-activated protein kinase 15...     

基于高通量测序技术分析家兔感染猪瘟兔化弱毒株后脾脏的转录组学变化

本研究基于高通量测序技术对感染猪瘟兔化弱毒株(C株)后0h,12h,24h,30h,36h,48h的家兔脾脏组织进行测序,以家兔基因组作为参考,筛选感染后各时间点和对照组(0h)之间的差异基因。利用Uniprot和NCBI数据库查找各组中变化水平显著的前10个差异基因的生物学功能。结果发现,感染后12h,24h,30h的前10个差异基因只有少数与炎症、免疫、凋亡等相关;感染后36h,48h的前10个差异基因完全相同,其中B2M、RLA-DR-ALPHA、CD74和IGJ参与抗病毒过程。GO功能注释结果显示:感染后各时间点的差异基因都和免疫、代谢、调控途径紧密相关。KEGG通路富集分析发现,感染后24h的差异基因富集到RIG-I样受体信号通路,感染后30h的差异基因富集到黏着斑和细胞外基质-受体相互作用通路,感染后36h和48h的差异基因共同富集到的通路有20个,其中蛋白酶体,溶酶体,核糖体,趋化因子信号通路,B细胞受体信号通路,抗原加工提呈通路和FcγR介导的吞噬通路与抗病毒相关。本研究建立的家兔感染C株后脾脏组织的差异表达基因数据库,将为进一步阐述家兔适应C株的分子机制奠定基础。     

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1高表达抑制黑素瘤细胞在小鼠体内的生长

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antienzyme inhibitor-1,OAZI-1)是细胞内调节多胺代谢的重要蛋白质因子。已有研究发现,OAZI-1高表达的黑素瘤细胞在体外能更有效地被抗原提呈细胞识别和吞噬,提示OAZI-1在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。为进一步分析OAZI-1高表达对黑素瘤细胞在小鼠体内生长的影响,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞(B16/OAZI-1)被接种到实验小鼠体内,结果发现,接种瘤出现先成瘤随后逐渐消退的现象,至第24 d时,接种瘤的平均体积为36±25 mm3~,而对照细胞接种瘤的平均体积为326±309 mm~3。为探索上述现象的机制,随后分析了B16/OAZI-1在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫效应,结果发现:1)B16/OAZI-1接种显著增加了小鼠脾脏细胞对B16-F1瘤细胞的杀伤活性;2)源于B16-F1的细胞抗原能更有效地促进B16/OAZI-1接种小鼠脾脏细胞的增殖;3)B16/OAZI-1接种小鼠的脾脏细胞具有更强的分泌IFN-γ的能力;4)当在预接种B16/OAZI-1 30 d后的小鼠体内再次接种B16-F1活细胞时,新接种瘤细胞的生长受到显著抑制,小鼠的存活率增加。上述研究结果提示,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞在实验动物体内的生长受到显著抑制,其机制可能与OAZI-1能促进肿瘤抗原提呈和诱导抗肿瘤免疫效应相关。     

早期停育胚胎的滋养层细胞相关基因与特征分析

滋养层细胞对维持正常胚胎植入、生长发育有重要作用。研究停育胚胎的滋养层细胞的基因表达差异有助于了解胚胎发育停止或不良妊娠结局的发生发展机制。本研究通过对26例正常妊娠、胚胎停育妇女的绒毛组织进行全转录组测序和初步生物信息学分析,发现胚胎停育组存在436个差异基因,其中406个mRNA为显著上调基因,32个mRNA为显著下调基因。基因富集分析显示这些基因显著富集于免疫相关功能、细胞间黏附等方面,如淋巴细胞激活、髓系细胞激活、细胞外基质及胶原连接等,其潜在调控通路富集到补体及凝血级联反应和细胞外基质降解等条目。此外,本研究利用WGCNA共表达分析得到和差异基因存在共表达关系的lncRNA。根据模块功能不同,绘制了两个网络图,可得4个关键基因,分别为VSIG4、C1QC、CD36和SPP1。本研究得到的这些差异基因可作为对胚胎停育具有潜在影响的关键分子,所富集到的条目可为深入了解胚胎发育停止或不良妊娠结局的病因及机制提供理论依据及方向。     

Proteomic studies of B16 lines: involvement of annexin A1 in melanoma dissemination

To identify proteins involved in melanoma metastasis mechanisms, comparative proteomic studies were undertaken on B16F10 and B16Bl6 melanoma cell lines and their subsequent syngenic primary tumours as pulmonary metastases were present only in the mice bearing a B16Bl6 tumour. 2DE analyses followed by MALDI-TOF identification showed variations of 6 proteins in vitro and 13 proteins in vivo. Differential expressed proteins in tumours were related to energy production and storage. Two differentially expressed proteins which had not been previously associated to melanoma progression, annexin A1 (ANXA1) and creatine kinase B (CKB), were found both in cells and in tumours. To characterize ANXA1 involvement in melanoma B16 dissemination, we reduced ANXA1 protein level by siRNA and observed a significant decrease of B16Bl6 cell invasion through Matrigel coated chambers. We further demonstrated that the presence of several formyl peptide receptors (FPR1, FPRrs1 and 2) revealed by qRT-PCR, played a role in B16 invasion: incubation of B16Bl6 cells with the FPR agonist (fMLP) or antagonist (tBOC) enhanced or decreased Matrigel coated chamber invasion respectively, with a correlation of ANXA1 levels in both treatments. As ANXA1 could bind to FPRs, this should amplify invasion and enhance melanoma dissemination.     

Identification of messenger and long noncoding RNAs associated with gallbladder cancer via gene expression profile analysis

The present study aimed to investigate the long noncoding RNAs (lncRNAs) and messenger RNAs (mRNAs) involved in the progression of gallbladder cancer and explore the potential physiopathologic mechanisms of gallbladder cancer in terms of competing endogenous RNAs (ceRNAs). The original lncRNA and mRNA expression profile data (nine gallbladder cancer tissues samples and nine normal gallbladder samples) in GSE76633 was downloaded from the Gene Expression Omnibus database. Differentially expressed mRNAs and lncRNAs between gallbladder cancer tissue and normal control were selected and the pathways in which they are involved were analyzed using bioinformatics analyses. MicroRNAs (miRNAs) were also predicted based on the differentially expressed mRNAs. Finally, the co-expression relation between lncRNA and mRNA was analyzed and the ceRNA network was constructed by combining the lncRNA-miRNA, miRNA-mRNA, and lncRNA-mRNA pairs. Overall, 373 significantly differentially expressed mRNAs and 47 lncRNAs were identified between cancer and normal tissue samples. The upregulated genes were significantly enriched in the extracellular matrix (ECM)-receptor interaction pathway, while the downregulated genes were involved in the complement and coagulation cascades. Altogether, 128 co-expression relations between lncRNA and mRNA were obtained. In addition, 196 miRNA-mRNA regulatory relations and 145 miRNA-lncRNA relation pairs were predicted. Finally, the lncRNA-miRNA-gene ceRNA network was constructed by combining the three types of relation pairs, such as XLOC_011309-miR-548c-3p-SPOCK1 and XLOC_012588-miR-765-CEACAM6. mRNAs and lncRNAs may be involved in gallbladder cancer progression via ECM-receptor interaction pathways and the complement and coagulation cascades. Moreover, ceRNAs such as XLOC_011309-miR-548c-3p-SPOCK1 and XLOC_012588-miR-765-CEACAM6 can also be implicated in the pathogenesis of gallbladder cancer.