焦磷酸测序技术及应用

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是一种新的DNA序列分析技术,其特点是操作简便、大通量、自动化,适合大量样本的快速检测,无须进行电泳、DNA序列无须荧光标记等,是一个理想的遗传分析技术平台.文章对焦磷酸测序技术原理及近年来在单核苷酸多态性研究、微生物鉴定分型和DNA甲基化等方面的应用作一简要综述.     

焦磷酸测序技术其在分子生物学领域的应用

焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列的目的。操作中不需要电泳、样品标记和染色,具有高度的可重复性,并行性和自动化特点,本综述了焦磷酸测序技术的基本原理,测序过程和它在SNPs研究,病原微生物的快速鉴定、病因学分析、法医鉴定等方面应用。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

基因编辑技术发展迅速,但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法,以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标,有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物,并进行有效性检测,分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验,建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明,基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比,该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点,在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。     

应用焦磷酸测序技术快速检测猪流感病毒金刚烷胺耐药性的分子标签

【目的】本研究旨在通过焦磷酸测序技术对我国分离的H1N1、H3N2、H9N2等3种基因型的10株猪流感病毒分离株进行金刚烷胺耐药性鉴定。【方法】流感病毒M2蛋白5个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对2004-2008年国内分离的10株猪流感病毒M基因金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。【结果】基于M2蛋白基因保守区序列建立的焦磷酸测序技术能用于国内猪流感病毒的快速检测,且具有较好的特异性和重复性。抗药性分析表明10株猪流感病毒国内分离株中5株H1N1分离株全部耐药,主要存在M2蛋白的V27T、V27I或S31N位点的突变,而4株H3N2和1株H9N2猪流感病毒分离株在M2蛋白5个关键位点上均未出现变异,表明其对金刚烷胺敏感。【结论】基于M基因的焦磷酸测序技术可以用于我国猪流感病毒金刚烷胺耐药性快速鉴定。     

基于焦磷酸测序技术的 基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

基因突变检测在肿瘤等疾病的早期诊断、个体化给药指导、疾病治疗进程与耐药监控等方面具有极其重要的意义。随着测序技术的 不断发展,DNA 突变的检测与分析已为病毒感染、血液病和实体瘤等疾病的个体化诊治提供重要参考。焦磷酸测序技术是一种基于生物发 光法测定焦磷酸盐的实时 DNA 测序技术,其用于 DNA 序列分析时不需电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,易于实现自动化,在基 因突变检测分析与肿瘤等疾病诊治中发挥巨大作用。综述基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗和疾病诊断中的应用 研究进展。     

焦磷酸光化测序技术的发展和应用

人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平,而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。正是在这样的历史背景下,焦磷酸光化测序技术(pyrosequencing)由瑞典研究人员发明。焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于"通过合成测序"原理进行酶促反应的DNA测序方法,通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测,即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定,以及DNA甲基化水平变化的分析等。近年来,随着摄影器材和成像技术的快速发展,这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光,因此,有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献,首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理,然后介绍该技术的应用,最后讨论其发展前景。     

焦磷酸测序测定SNP的常见问题与解决方法

目的：探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法：以VKORC1基因1639 G〉A位点、CYP2C19基因636 G〉A位点及UGT1A1基因TA重复序列（TA）6〉（TA）7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果：通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 G〉A位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列（TA）6〉（TA）7多态性的分型准确性。结论：本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。     

焦磷酸测序测定SNP的常见问题与解决方法

目的:探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法:以VKORC1基因1639 GA位点、CYP2C19基因636 GA位点及UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果:通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 GA位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7多态性的分型准确性。结论:本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。     

乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的：建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法：针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果：构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论：成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

焦磷酸测序检测食品中鼠伤寒沙门氏菌

根据鼠伤寒沙门氏菌的特异序列,分别设计扩增引物和测序引物,建立焦磷酸测序检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌设计特异性扩增引物,对目标片段进行PCR扩增,然后制备单链模板,并利用测序引物进行焦磷酸测序。测序结果表明,6株不同来源的鼠伤寒沙门氏菌均可以扩增出碱基序列为TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC的基因片段,而30株阴性对照菌株均未得到扩增。进行BLAST比对表明,该序列与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的碱基序列100%匹配。焦磷酸测序法是一种快速、准确的检测方法,可用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。     

肉类掺假检测技术研究进展

肉类掺假现象严重威胁公共卫生安全。快速、准确、可靠的动物源性成分检测技术是有效监管与检测肉类掺假的关键。总结了常见的掺假形式,并对物理技术、光谱技术、免疫学技术、DNA分析等检测方法进行了全面的总结归纳和比较分析,尤其是对当前热门的DNA分析方法,详细阐述了常规PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR和等温扩增PCR这4种主要分子检测技术的优缺点和应用情况,旨在为未来动物源性检测技术的发展指明方向。     

10种植物乙醇提取物对金银花蚜虫的生物活性研究

采用微量滴定法测定了10种植物乙醇提取物对金银花蚜虫的生物活性.结果表明,10种植物乙醇提取物对金银花蚜虫均有一定的驱避活性和毒杀作用.在10 mg/mL的浓度下,臭椿、曼陀罗和桂花的提取物对金银花蚜虫的驱避作用较强,其在12 h的驱避率分别为78.74％、77.54％、75.11％;夏枯草提取物的驱避效果最弱,12 h的驱避率为58.53％.随着处理时间的延长,各植物提取物的驱避效果均呈下降趋势;印楝提取物的毒杀活性最强,72 h后的校正死亡率达68.30％;曼陀罗和苦瓜的作用次之,72 h后的校正死亡率分别为66.41％和63.70％;夏枯草提取物的作用最低,72 h后的校正死亡率仅为26.47％.进一步的毒力分析表明,印楝提取物对金银花蚜虫的毒力较强,24h的Lc.值为11.0836 mg,/mL.     

基于专利分析的干细胞技术创新趋势研究

干细胞(Stem Cells)是当今世界科学研究的热门领域。本文对Derwent Innovation Index(DII)专利数据库收录的1975-2013年世界范围内申请的干细胞技术专利进行了数据计量分析,给出了干细胞专利的年度分布、地区分布、研发重点分布、机构分布等,揭示了已展现出明显优势的干细胞技术的创新现状和发展趋势,所得到的结果可为这种新技术的研发决策提供支持与依据。研究发现,干细胞技术近年来发展迅速,美国和中国对干细胞领域研究资助力度持续加大,美国和日本在干细胞研究领域占据主导地位,目前正处新一轮发展阶段。     

茎尖法转基因棉花植株真实性鉴定方法探究

棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA（16S rRNA）片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。     

基于声测经络技术的实验大鼠常用经穴检测

目的客观确定实验大鼠常用经穴。方法依据穴位处高导声状态的特性,应用声测经络技术,将声波波幅值较高点确定为大鼠经穴点。结果大鼠经穴皮肤声波波幅值较经穴旁对照点显著增大（P〈0.05）。结论大鼠经穴与人体经穴具有相同的生物物理学特性,与人体经穴类似。     

肉类及肉制品中动物源性成分鉴别方法研究进展

肉类掺假问题直接影响着人类健康、公共卫生安全以及社会稳定等方面,成为当今食品安全热点话题之一,因此,高效、精确的肉类及肉制品中动物源性成分的检测鉴定势在必行。基于此,主要介绍了对于动物源性成分检测及鉴别的不同研究方法,分析了利弊,并对后续肉类及肉制品中动物源性成分的鉴别方法的研发方向进行了展望,以期为此领域提供资料性参考。     

用菌紫质薄膜传感器进行图像边缘检测的研究

应用菌紫质人工沉淀膜所具有的与动物视网膜类似的微分光电响应特性,以该人工膜为传感器构建了一个可检测图像边缘的原理系统,并成功地检测到了简单图像的边缘。本文的结果除进一步说明了菌紫质分子在图像技术中的应用前途外,还说明了这种分子在视觉功能模拟和人工视觉等方面的良好应用前景 。     

基于专利分析的医学科技重点技术前沿领域的识别研究

目的:采用定量分析与定性分析相结合的方法识别医学科技重点技术前沿领域。方法:在Thomson Innovation数据库中检索2006-2012年制药技术、生物医药技术和医疗器械三个领域申请的专利数量,采用专利计量分析、统计学趋势分析等定量分析方法结合专家专业知识的定性分析方法对检索、采集的专利进行分析并识别前沿领域。前沿领域的选择原则是专利申请数量标化平均值较高(制药技术、生物医药技术和医疗器械领域标化平均值分别选择大于10%、15%和20%的子领域),或者有显著性增长趋势(P0.05且b0)。结果:本研究共识别医学科技重点技术前沿领域12个,其中制药技术前沿领域4个,分别是:天然产物,普通药,杂环化合物和其他有机物;生物医药技术前沿领域4个,分别是:疾病诊断和检测,基因治疗和核苷类药物,蛋白多肽类药物和生物合成技术;医疗器械前沿领域4个,分别是:电子医疗设备,诊断及手术设备,消毒、注射及电疗设备和医疗救助及口服设备。结论:通过定量与定性分析方法相结合共识别医学科技重点技术前沿领域12个,对专利进行多角度分析可以全面把握前沿领域的技术发展方向和特点,为我国医学科技政策的制定提供基于数据和事实的信息支撑。