CRISPR/Cas系统在抗病毒研究中的应用

近年来,CRISPR/Cas系统因其效率高、靶向性强、易操作等优势,已被广泛应用于多种病毒研究中。本文首先简单介绍了CRISPR/Cas系统的分类,并比较了Cas9和Cas12a与Cas13a的特点;其次重点介绍了CRISPR/Cas9通过靶向破坏病毒基因组,或编辑宿主关于病毒生命周期的关键因子的策略在抗病毒方面的各种应用,CRISPR/Cas13a采用靶向破坏病毒基因组方法在抗病毒中的应用,以及CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a在病毒基因检测中的应用。最后讨论了CRISPR/Cas在病毒研究中面临的挑战,并讨论了CRISPR/Cas12a作为抗病毒工具的潜在应用前景。由于CRISPR/Cas系统自身的优势,预计该系统将会给病毒相关的疾病诊断和控制带来革命性的变化。     

基于CRISPR/Cas的分子诊断传感器在非核酸分子诊断中的应用

CRISPR/Cas不仅是一种重要的基因编辑工具,而且还是一种有效的分子诊断工具。目前基于CRISPR/Cas建立了一系列的分子诊断传感器系统,广泛应用于核酸、非核酸等检测过程中。与应用较广泛的核酸分子诊断传感器系统相比,基于CRISPR/Cas的非核酸检测系统目前尚未见系统性综述,因此本文围绕基于CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13建立的两大类非核酸分子传感器诊断系统的基本特征、工作流程及其检测原理等进行了全面综述,期望能为CRISPR/Cas分子诊断系统在体外诊断中的应用提供依据。     

CRISPR相关生物信息学基础

成簇规律间隔短回文序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得的一种适应性免疫防御机制,该结构与一些功能相关的蛋白质（CRISPR associated, Cas）合称CRISPR Cas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点,近年来对CRISPR/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。但是,该系统存在脱靶效应、测序数据分析等挑战。为此,许多研究者开发出各种软件解决以上问题。本文着重从生物信息学的角度出发,对CRISPR/Cas系统中sgRNA的设计软件、CRISPR全基因组筛选功能基因的测序数据分析软件以及CRISPR在生物信息学中的运用作一系统综述。     

CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响北大核心CSCD

【目的】了解志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布及其与毒力和耐药的关系,并分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【方法】利用课题组前期设计的引物PCR扩增志贺菌的3个CRISPR位点、CRISPR相关蛋白基因cse2、耐药基因和毒力基因;改良Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行药敏试验;台盼蓝计数试验检测细菌毒力;Real-time PCR检测志贺菌中cse2基因m RNA表达水平。分别分析志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药基因、耐药表型、毒力基因、毒力表型的关系;了解IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【结果】志贺菌中CRISPR1位点阴性细菌的毒力强;插入序列IS600使cse2 m RNA表达水平降低。【结论】志贺菌中存在CRISPR1、2、3位点;CRISPR1位点与毒力有关;插入序列IS600对cse2 m RNA表达水平有影响。     

The CRISPR/Cas Adaptive Immune System of Pseudomonas aeruginosa Mediates Resistance to Naturally Occurring and Engineered Phages

Here we report the isolation of 6 temperate bacteriophages (phages) that are prevented from replicating within the laboratory strain Pseudomonas aeruginosa PA14 by the endogenous CRISPR/Cas system of this microbe. These phages are only the second identified group of naturally occurring phages demonstrated to be blocked for replication by a nonengineered CRISPR/Cas system, and our results provide the first evidence that the P. aeruginosa type I-F CRISPR/Cas system can function in phage resistance. Previous studies have highlighted the importance of the protospacer adjacent motif (PAM) and a proximal 8-nucleotide seed sequence in mediating CRISPR/Cas-based immunity. Through engineering of a protospacer region of phage DMS3 to make it a target of resistance by the CRISPR/Cas system and screening for mutants that escape CRISPR/Cas-mediated resistance, we show that nucleotides within the PAM and seed sequence and across the non-seed-sequence regions are critical for the functioning of this CRISPR/Cas system. We also demonstrate that P. aeruginosa can acquire spacer content in response to lytic phage challenge, illustrating the adaptive nature of this CRISPR/Cas system. Finally, we demonstrate that the P. aeruginosa CRISPR/Cas system mediates a gradient of resistance to a phage based on the level of complementarity between CRISPR spacer RNA and phage protospacer target. This work introduces a new in vivo system to study CRISPR/Cas-mediated resistance and an additional set of tools for the elucidation of CRISPR/Cas function.     

CRISPR/Cas系统的分类及研究现状

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。     

Data Comparison and Software Design for Easy Selection and Application of CRISPR-based Genome Editing Systems in Plants

CRISPR-based genome editing systems have been successfully and effectively used in many organisms. However, only a few studies have reported the comparison between CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cpf1 systems in the whole-genome applications. Although many web-based toolkits are available, there is still a shortage of comprehensive, user-friendly, and plant-specific CRISPR databases and desktop software. In this study, we identified and analyzed the similarities and differences between CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cpf1 systems by considering the abundance of proto-spacer adjacent motif (PAM) sites, the effects of GC content, optimal proto-spacer length, potential universality within the plant kingdom, PAM-rich region (PARR) inhibiting ratio, and the effects of G-quadruplex (G-Q) structures. Using this information, we built a comprehensive CRISPR database (including 138 plant genome data sources, www.grapeworld.cn/pc/index.html), which provides search tools for the identification of CRISPR editing sites in both CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cpf1 systems. We also developed a desktop software on the basis of the Perl/Tk tool, which facilitates and improves the detection and analysis of CRISPR editing sites at the whole-genome level on Linux and/or Windows platform. Therefore, this study provides helpful data and software for easy selection and application of CRISPR-based genome editing systems in plants.     

CRISPR/Cas13系统敲减HEK293T细胞ku70和lig4基因表达

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associatedproteins,Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点,其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系统的开发为RNA的干扰和编辑提供了新的方向。文中针对HEK293T细胞非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)通路修复关键因子Ku70和Lig4的编码序列,设计并合成CRISPR/Cas13a、b系统相应的gRNA,检测其对ku70和lig4基因表达的影响。结果显示,Cas13a对ku70和lig4的RNA敲减效果可以达到50%以上,Cas13b对ku70和lig4的RNA敲减效果分别达到92%和76%;同时Cas13a、b系统能将Ku70和Lig4蛋白水平分别下调至68%和53%。CRISPR/Cas13系统可有效敲减HEK293T细胞RNA和蛋白质表达,为基因功能和调控研究提供一种新的策略。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统.目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具.自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长.农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物.本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景.     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

基于CRISPR/Cas技术的核酸检测研究进展

由成簇、规则间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于多数细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可识别并结合外源入侵的核酸分子,之后Cas蛋白的切割活性被激活,能够对入侵的核酸分子进行切割使其降解。利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性,将其应用于核酸检测中,为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。本文介绍了CRISPR/Cas系统的发展、作用机制等,对多样化的Cas蛋白在核酸检测中的代表性应用研究进行总结,进一步讨论了CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中存在的优缺点,并对未来研究进行了展望,为基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法在病原微生物的检测中提供参考和依据。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在番茄中的应用现状及展望北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术是一种能够快速对基因组靶位点进行特定DNA修饰的编辑工具。该文对近年来国内外有关CRISPR/Cas9技术在改善番茄农艺性状及提高生物、非生物胁迫抗性方面的研究进展进行综述,并集中讨论了CRISPR/Cas9面临的一些问题,为该基因编辑技术在番茄的种质创新及基因功能研究方面的应用提供参考。     

基于CRISPR/Cas系统的噬菌体基因组编辑

对原核生物获得性免疫系统CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR- associated genes)的研究促进了新一代基因组编辑工具的产生和发展。噬菌体既是原核生物CRISPR阵列(CRISPR array)进化的原动力,又是CRISPR/Cas系统防御的对象。噬菌体功能基因组学研究的速率却落后于发现新噬菌体和测定基因组序列的速率。基于CRISPR/Cas系统的噬菌体基因组编辑,可为噬菌体功能基因组学研究提供新手段。本文评述了基于CRISPR/Cas系统编辑噬菌体基因组的几例开创性研究,并且比较了多种操作程序的异同点和优缺点。同时,进一步构建了联合使用CRISPR/Cas系统与噬菌体重组系统开展噬菌体基因组编辑的新方案,讨论了新方案的潜在局限性,并对如何选择不同方案给予了建议。     

纳米粒子在CRISPR/Cas9基因治疗中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为基因治疗领域最有前景的工具。在临床应用中,对CRISPR/Cas9进行安全有效的递送一直是亟待解决的问题。纳米粒子,如脂基纳米粒子、聚合物纳米粒子、纳米金颗粒以及生物膜类纳米粒子等,因其生物相容性、安全性和可设计性等特点有望为基因治疗带来新的突破。文中首先对纳米粒子的特性和基因治疗中CRISPR/Cas9的发展进行了概述,然后详细归纳了纳米粒子在递送不同形式的CRISPR/Cas9中的应用,最后对纳米粒子介导的基因治疗的递送在未来面临的挑战和安全性等方面作出总结论述。     

CRISPR/Cas9-mediated correction of human genetic disease

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas) protein 9 system(CRISPR/Cas9) provides a powerful tool for targeted genetic editing. Directed by programmable sequence-specific RNAs,this system introduces cleavage and double-stranded breaks at target sites precisely. Compared to previously developed targeted nucleases, the CRISPR/Cas9 system demonstrates several promising advantages, including simplicity, high specificity,and efficiency. Several broad genome-editing studies with the CRISPR/Cas9 system in different species in vivo and ex vivo have indicated its strong potential, raising hopes for therapeutic genome editing in clinical settings. Taking advantage of non-homologous end-joining(NHEJ) and homology directed repair(HDR)-mediated DNA repair, several studies have recently reported the use of CRISPR/Cas9 to successfully correct disease-causing alleles ranging from single base mutations to large insertions. In this review, we summarize and discuss recent preclinical studies involving the CRISPR/Cas9-mediated correction of human genetic diseases.     

CRISPR/Cas9技术在微生物研究中的应用进展

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)系统是在细菌和古生菌中发现的一种RNA指导的降解入侵病毒或质粒DNA的适应性免疫系统。由II型CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas9技术已经被开发成一种强大的基因组编辑和表达调控工具,并且广泛应用于基因功能研究、代谢工程和合成生物学等领域。本文从CRISPR/Cas9系统的发现过程、分类、作用原理、在微生物研究中的应用进展等方面进行总结,并展望了该技术的应用前景。     

CRISPR/Cas9高通量筛选技术与肿瘤治疗

成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR),是细菌或古菌在与噬菌体长期生存进化获得的一种免疫系统. 根据Cas蛋白(CRISPR-associated protein)的不同,CRISPR系统可分为3种. 其中II型CRISPR/Cas9已被改造成为一种有效的基因编辑工具,并运用于多种物种基因的改造. 作为1种基因编辑的手段,CRISPR/Cas9技术通过诱导DNA双链断裂损伤,进一步干扰基因的表达. 与传统的基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9技术显示出效率高、成本低和易操作等特点. 与此同时,二代测序技术的发展促进全基因组的解析. CRISPR技术结合高通量二代测序手段的使用,在肿瘤的治疗领域中已发挥出了独特的优势. 本文就近年来CRISPR/Cas9高通量筛选技术的发展,及其在肿瘤治疗过程中的应用进行综述.     

The advancements,challenges, and future implications of the CRISPR/Cas9 system in swine research

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9) genome editing technology has dramatically influenced swine research by enabling the production of high-quality disease-resistant pig breeds, thus improving yields. In addition, CRISPR/Cas9 has been used extensively in pigs as one of the tools in biomedical research. In this review, we present the advancements of the CRISPR/Cas9 system in swine research, such as animal breeding, vaccine development, xenotransplantation, and disease modeling. We also highlight the current challenges and some potential applications of the CRISPR/Cas9 technologies.