医学分子遗传学讲座 第五讲限制性片段长度多态性

每个个休在溃传上是不同的,而不同的本质不是 在基因产物＿匕而是在DNA水平上的差异。这些差异 大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节 功能的区域发生了中立突变,这些中立突变所构成的 DNA变异称为DNA多态性。DNA多态性本质是 由于进化过程中的各种原因引起染色体DNA中核营 酸排列顺序发生了改变,当这种改变涉及到限制性内 切酶识别位点时,利用限制性内切酶可将DNA切割 成不同长度的限制性片段。这类不同长度的限制性片 段类型在人群中所呈现的多态频率分布现象,就称为 限制制性片段长度多态性（RFLP)o RFLP具有广泛 的用途,它可以作为一种“遗传路标”,对人类基因组制 图提供必要的标记,当多态性顺序与人类遗传性疾病 位点连锁时,可作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携 带者的标记,还可以应用于亲子鉴定和群体研究等方 面。     

限制性片段长度多态性（RFLPS）及其原因

DNA是绝大多数生物(RNA病毒除外)携带和传递遗传信息的复杂的生物聚合体。能被限制性核酸内切酶在特定的核苷酸顺序上切割,形成各种长度的DNA片段,通过电源能将这些片段分开。 生物个体间的差异,本质上是DNA水平上的差异。这是由于进化过程中染色体DNA上核苷酸顺序发生了改变,当这种改变涉及到限制性酶切位点时,酶切后产生的DNA片段长度     

粳稻品种秋光空间诱变突变体的微卫星分析

随机选用121对分布于水稻12条染色体上的微卫星引物对经卫星搭载的水稻品种秋光突变后代(SP10)7个株系进行分子检测,结果发现突变系与亲本秋光之间存在着不同程度的多态性,多态性位点的多少随突变系与原种间差异大小而变化;多数突变系和原种相比都存在多个位点突变。实验结果表明空间诱变可使植物DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异,其诱变机理和一般的诱变因素导致DNA少数碱基发生点突变不同。     

粳稻品种"秋光"太空诱变后代株系的微卫星标记分析

随机选用47对分布于水稻12条染色体上的微卫星引物,对经卫星搭载的水稻品种"秋光"突变后代(SP10)的75株系进行分子检测,结果发现:突变株与引变亲本"秋光"之间存在着不同程度的微卫星多态性,多态性位点随突变株和诱变亲本"秋光"之间的差异大小而变化.多数材料都存在多位点突变,表明太空环境可使DNA分子多区段发生重复或缺失等结构性变异,这些结果和通常人们认为理化因素诱变产生少数位点碱基发生点突变不同.     

人胃及其癌组织的RAPD多态性分析

为了研究细胞癌变后DNA结构的改变,探讨这种改变和肿瘤发生、发展 的关系,用AP-PCR扩增胃癌及其癌旁和正常组织DNA。结果表明,引物P1（5′CGGCCCCGGT3′）对上述三种组织的扩增产物的电泳图谱表现出多态性;然而,引物P2（5′TTTGCCCGGT3′）对上述三种组织的扩增产物的电泳带型一样,没有表现出多态性。这说明,细胞癌变后DNA结构在引物PI顺序处发生了突变;这些突变可能和细胞的癌变有关。     

藏獒MC1R基因多态性与毛色表型的关联研究

目的:通过检测藏獒黑素皮质激素受体1(MC1R)基因的单链构象多态性(SSCP)在不同毛色群体中的分布,探讨MC1R基因多态性与毛色表型的相关性。方法:采用DNA测序技术,选择不同毛色藏獒的DNA为样本,根据GenBank发布的荷斯坦牛MC1R基因序列设计一对引物,采用PCR-SSCP技术分析MC1R基因在藏獒中的SSCP。结果:MC1R基因在藏獒中具有PCR-SSCP多态性,分别检测到3种基因型(AA、AB和BB);对MC1R基因多态性片段DNA克隆测序后发现,MC1R基因在编码区第313位存在单碱基突变(G→A),该突变导致第105位氨基酸发生由丙氨酸向苏氨酸的改变(T105A)。结论:MC1R基因的多态性与毛色性状不存在显著的相关性。     

寡核苷酸诱导的定点突变

蛋白质工程是生物技术中正在开发的一个新领域。由于它是一门从改变基因入手,制造新的蛋白质的技术学科,因此改变基因的方法就成为蛋白质工程的主要内容之一。 十年来由于重组基因和DNA序列分析方法得到成功,因此很多科学家的注意力都集中到研究DNA编码区域序列结构与功能的关系,发展了各种体内,体外突变方法。改变某一特定区域的DNA结构,用以确定DNA特定区域的功能。     

小鼠Agouti基因变异及生物信息学分析

目的分析候选基因Agouti的多态性,揭示染色体工程小鼠毛色差异的分子机制。方法首先,用测色仪检测小鼠的毛色差异。其次,利用DNA芯片进行全基因组扫描确定候选基因Agouti。最后,运用生物信息学软件分析Agouti基因cDNA序列和氨基酸序列的多态性,预测突变对蛋白结构和功能产生的影响。结果发现Agouti基因cDNA序列上存在5个SNPs,使Agouti信号蛋白产生了3个错义突变。生物信息学分析发现,其中一个错义突变使该蛋白丢失了一个β折叠,并且其三级结构发生改变,最终导致与受体结合的能力相较于野生型有所下降。结论在毛色基因Agouti的编码区发现了一个新的错义突变,该突变使Agouti信号蛋白与受体结合能力下降,最终导致小鼠的毛色由浅灰色变为深灰色。     

橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析

为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)自根幼态无性系与供体间差异产生的原因,应用甲基化敏感扩增多态性扩增技术,对巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组DNA 胞嘧啶甲基化程度和模式进行了分析。结果表明,在巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同阶段的DNA 甲基化程度不同,以花药的DNA 甲基化程度最高,体细胞胚的DNA 甲基化水平最低。在体细胞胚发生过程中出现了I、Ⅱ和Ⅲ 3 种类型的甲基化多态性带型的改变,包括他们的出现与消失。因此,橡胶树体细胞胚发生过程中可能通过DNA 甲基化甲基化和去甲基化来调控基因的表达。     

Smad1在结直肠癌中的突变及功能分析

DNA损伤是肿瘤发生的基础,细胞内应答DNA损伤的分子信号通路是阻挡癌症发生的屏障。近年来发现Smad1在DNA损伤应答的分子信号通路中具有重要的作用。本实验旨在探究结直肠癌患者组织中Smad1的序列突变及其生物学意义。本实验提取结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的总RNA并逆转录成c DNA,分段扩增Smad1基因并进行克隆和双向测序,测序结果进行比对,发现Smad1的MH1区域与MH2区域的错义突变较少,6个主要的错义突变均集中在Linker区域,其氨基酸残基改变分别是:N147H、P167S、T202A、M218I、M247V和A248V,其中Thr202是已知的GSK3作用位点;正常组织及肿瘤组织中的突变情况不同,T202A和M218I分别是仅存在于正常组织和肿瘤组织中的突变,提示Smad1 Linker区域的突变可能影响其生物学功能。并利用RNAfold和SOPMA在线服务器分别预测发现错义突变对Smad1的RNA二级结构和蛋白质二级结构造成不同程度的影响。     

人类基因组核苷酸多态性位点核小体定位分析

研究人类基因组核苷酸多态性位点周围核小体的定位,对于分析核苷酸的变异机制有重要意义.分析了人类基因组单核苷酸多态性(SNP)位点、简单插入位点、插入删除位点和删除位点的分布规律,以及这些位点周围的核小体定位特征.结果表明:转录起始位点下游的核苷酸多态性位点分布呈现约211 bp的周期特征,单核苷多态位点另有一个146 bp的周期;约211 bp的周期与转录起始位点下游核小体的分布周期204 bp非常接近,146 bp的周期恰是核小体核心DNA的长度.这些结果说明核小体与多态性位点的分布关系密切.进一步研究证实,单核苷酸多态性位点多分布于核心DNA上,且多位于核心DNA的两端,这使得单核苷酸多态性位点具有146 bp周期,而插入、插入删除、删除多态性位点多分布于核小体排开区域,间隔约为204 bp.转录起始位点下游核小体等间隔的规则分布使得多态性位点的分布也具有周期性.研究表明,相对于核小体,不同类型变异发生的位置不同,核小体定位在基因组多态性位点的形成过程中具有重要作用.     

香菇三个功能基因部分序列的单核苷酸多态性分析

以15个香菇栽培品种为材料,对尿嘧啶核苷酸-胞嘧啶核苷酸激酶基因(UMP-CMP kinase gene,uck1)、分裂原活化蛋白激酶基因(mitogen-activated protein kinase gene,mapk)和外切β-1,3葡聚糖酶基因(exo-β-1,3-glucanase-encoding gene,exg1)进行了部分序列的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析。结果表明,测序中出现的双峰,是菌丝双核体细胞中两细胞核之间的差异造成的。在采用uck1、mapk和exg1的3,126bp中,共发现48处多态性位点,发生频率为1/65bp,其中36个属于转换、12个为颠换。从群体发生频率上,38个属于超过10%的常见SNP,10个属于罕见SNP。不同基因的SNP发生频率不同,uck1、mapk和exg1的SNP发生频率分别为1.40%、0.82%和2.41%。外显子区SNP数量高于内含子,3个基因在外显子区域分布28个,内含子分布20个。外显子的28个SNP位点中,11个为错义突变,17个为同义突变。错义突变引起了编码氨基酸的改变。对SNP位点的聚类分析表明,15个栽培品种间存在的多态性位点在1–36之间,15个品种的SNP类型不同。uck1,mapk,exg1的SNP可用于香菇栽培品种的鉴别。     

遗传学的基本原理(十)“地位效用”与基因学说

结构突变基因突变只代表着一种突变,另外一种是所谓结构突变。结构突变与基因突变的不同是在这里我们可以看到发生突变生物个体的染色体起了变化,而且这些变化多少与法外交换有关。换句话说,基因突变与结构突变主要区别是前者在染色体上我们找不到变化而后者却由于染色体上超了变化而产生的。早在 X 线放     

我国烟蚜种群分化的RAPD分析

用RAPD-PCR技术研究了我国烟草上烟蚜Myzus persicae (Sulzer)的种群分化。结果表明：我国烟蚜的不同地理种群和不同体色之间DNA均呈现出多态性,且不同的引物可在不同水平上反应出烟蚜种群的DNA多态性。Nei的遗传距离表明我国烟草上烟蚜的分化仅在种群水平上,并未达到亚种水平。用相似性指数和Nei的遗传距离对所筛选的三个引物OPX-04、OPX-06和OPX-19的扩增结果进行聚类,虽然二者的结果不一致,但均可反应出烟蚜的地理种群和体色生物型的DNA差异。在DNA水平上,与完全周期生活史的烟蚜相比,完全周期和不完全周期生活史混合发生的烟蚜与不完全周期生活史的烟蚜更为接近,而两种生活史混合发生的烟蚜之间无明显差异。从体色看,红色比黄绿色更接近褐色。     

DNA单链二级结构预测与单链构象多态性分析的一致性研究

单链构象多态性(SSCP)分析是一种简便,快速检测DNA突变的方法,它在基因突变检测、遗传分析、进化研究等领域有着广泛的应用价值.但是这种方法的突变检出率随DNA序列不同而变化,一般只能达到70%～80%.这主要是有的碱基突变对单链DNA的构象影响较小,不能通过SSCP检测出来.将计算机对DNA二级结构的预测结果和实验结果作了对比,发现二者有很高的一致性.这一结果表明计算机的DNA单链二级结构预测分析可用于PCR-SSCP分析的辅助设计,提高SSCP的突变检出率.     

肝癌组织中线粒体DNA D-Loop区碱基变异与ROS水平

为了探讨ROS水平与突变的关系,对原发性肝癌线粒体DNA区的突变情况进行研究,同时对原发性肝癌患者组织细胞内ROS进行测定。选择20例原发性肝癌组织及其邻近的癌旁组织,用PCR方法将线粒体DNA D-Loop扩增后测序。组织内ROS的水平采用流式细胞技术测定。结果表明在20对原发性肝癌组织中存在8对mtDNA突变,突变率为40%,共发现突变位点53个,包括2个插入,11个缺失,40个点突变,其中T-C,C-T的转换占75%,4个属于微卫星结构。癌组织突变一般伴有癌旁组织突变,癌组织突变位点高于癌旁组织。发现一例标本的癌组织和癌旁组织均有大片段丢失。原发性肝癌组织内ROS水平明显高于癌旁对照( P<0.01),同时我们发现在区发生突变的患者的组织中ROS水平明显高于未发生突变的肝癌组织标本（P<0.01）,发生突变的癌旁组织内ROS水平明显高于未发生突变的癌旁组织（P<0.01）。结论 (1)线粒体DNA D-Loop区是一个高度多态性和突变性的区域,在原发性肝癌中突变率较高。(2)肝癌患者组织细胞内ROS异常,提示肝癌的线粒体DNA发生的点突变及肝癌的发生可能与ROS升高有关。     

空间搭载诱导水稻种子突变的分子标记多态性分析

以卫星空间搭载广东水稻品种特籼占13干种子,返地种植后经5代选择、培育,获得一批形态及育性变异的突变体及品系（种）,如株高变矮,稻穗变大,雄性不育等。为了探索空间诱变的本质,对选出的6个突变体及2个优良品系,选用了130个10－mer随机扩增多态性DNA（RAPD经物和17对扩增片段长度多态性（AFLP）引物组合,分别对其基因组DNA进行多态性位点扫描分析,两种方法的结果均显示：不同的突变体与原种DNA之间存在不同程度的多态性差异,且由两法得到的结果较接近,为6％－12％。此结果从分子水平上进一步证明了空间环境确实对植物种子存在诱变作用。     

不同生境下的钝顶螺旋藻RAPD分析

本文对不同生境下的钝顶螺旋藻Spirulina (Arthrospira) platensis进行了RAPD分析。结果表明, 鄂尔多斯高原碱湖和Chad湖的钝顶螺旋藻基因组DNA扩增多态性片段同源性为 48.23%。2 个样品在分子遗传水平上存在着较大的差异, 这是由于各自生态环境明显不同和长期地理隔离造成的。     

浙江省非综合征型耳聋患者12SrRNA突变频谱分析

线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)突变是引起耳聋的重要原因之一。尤其是12S rRNA基因是药物性耳聋与非综合征型耳聋相关的突变热点区域。文章收集了浙江省各地区非综合征型及药物性耳聋患者标本318例,对其进行临床和分子遗传学评估。12S rRNA基因突变分析发现34个变异位点,已知的1555A>G、1494C>T和1095T>C突变分别占9.1%、0.6%和1.25%。结构和种系发生分析显示,839A>G和1452T>C突变位于12S rRNA基因的高度保守区域且未在449例正常对照组中发现,可能增加了耳毒性药物的敏感性。其他变异位点为多态性位点。文章数据支持了12S rRNA基因是耳毒性药物的作用靶点之一这一理论,为预测个体耳毒性的发生风险,提高氨基糖甙类药物治疗安全性提供了有价值的信息,以期降低耳聋的发生。     

RAPD标记鉴定水稻3种不同细胞质雄性不育类型的杂交种及其亲本

利用RAPD引物对3种不同细胞质雄性不育类型的杂交水稻组合及其亲本共21个材料进行了DNA多态性分析。从264个随机引物中筛选出具有非常明显多态性的引物25个, 对25个引物在3种不同细胞质不育类型的杂交组合及其亲本间的DNA扩增多态性差异进行比较,最终选出具有不同类型间特异性扩增带的引物7个,利用这些特异性扩增带能有效地区分和鉴定目前在生产上大面积种植和推广,或者是具有应用潜力的3种不同细胞质雄性不育类型—野败型(WA)、红莲型(HL)和包台型(BT))—的6种杂交水稻组合及其亲本。