一个实用的制备EMBL4 DNA 的方法

以往人们通常用氯化铯梯度超速离心法、甘油梯度超速度离心法等方法纯化噬菌体。采用这些方法,虽然可以获得纯净的λ噬菌体颗粒。但需要昂贵的试剂和仪器。操作也冗长繁琐。我们采用并改进了Reddy的方法,首先用DE_(52)纤维素柱层析纯化λ噬菌体颗粒,然后用酚抽提,从提纯的噬菌体中分离DNA,这个方法简单快速,不需要氯化铯梯度超速离心,也不使用SDS、蛋白酶和核酸酶。     

用改良酸酚法从大肠杆菌中大量分离纯化质粒DNA

在进行DNA重组和大量制备’2p标记的 DNA分子探针过程中,我们参照Clewell等〔41清 亮裂解液方法和Zasloff等fsl的酸酚法,综合发 展了一种大量分离纯化质粒DNA的清亮裂解 液一酸酚法此方法操作简便、重复性好、产量高, 其纯度和生物活性可满足DNA重组与制备32p 标记DNA探针的要求,既省去了昂贵费时的 氯化艳一澳化乙咤密度梯度超离心,又避免了细 菌裂解液直接酚提时溶液过于粘稠、不易操作、 收率低的缺点。并证实了经酸酚处理后的质粒 DNA可用于DNA重组。     

用琼脂糖凝胶制备电泳— 冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展，DNA 做 为一种实验材料要求纯化方法更加简便，质量 更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许 多报道fs-5I。国外多采用氯化艳密度梯度离心 法，国内则限于条件，很少应用此法。我们建 立了琼脂糖制备电泳— 冻融法，以纯化质粒 DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行，而 且效果良好。     

一种从培养细胞中分离高分子量DNA的有效方法

简便快速地分离高分子量DNA技术,无论对核酸分子生物学基础研究还是对重组DNA研究都是十分必需的。Blin和Stafford报道了从组织培养细胞中分离高分子量DNA的方法,此方法步骤繁杂,包括酚、氯仿等有毒溶剂抽提、RNase处理、较长时间反复透析乃至长时间氯化铯梯度离心等,所得样品经乙醇沉淀后往往溶解度偏低。但由于此法确能得到较高分子量的DNA制品,所以沿用至今。近年来由于     

质粒DNA的人工氯化艳线性梯度分离法

在遗传工程技术中,质粒被广泛用作重组 DNA的载体,有些肠道菌的致病基因位于大质 粒上。要克隆这些基因,先要纯化质粒,迄今 为止,已经有不少精制质粒的方法^[57]。经典的均 一CsCI-EB密度离心法,需长时间的离心,使其 形成Cscl梯度,约40-60小时方能达到纯化 的目的。本法做了一些改进,采用0.6M和6M 两种不同的Cscl溶液,用日立DGF-U梯度 仪配成线性梯度,然后加粗提的质粒DNA和 EB的混合液,以日立RPS-65T水平转头,200C, 48,000rpm（约为160,000g）离心,小时,就能 把粗制pBR322样品中的染色体、开环（oc）和 共价闭合环状（ccc)质粒DNA分开。从而获 得纯的cc。质粒。带定居因子K88ac抗原的毒素 源性大肠杆菌野生型菌株,含有50 Md的大质 粒和一个小质粒,用酸酚法^[7]、两相法^[3]、蔗糖梯 度离心法、均一氯化艳-EB离心法、不连续（或 阶梯梯度）梯度Cscl离心法^[2]琼脂糖凝胶电 泳法^[6]等都难以获得纯的大质粒,用本文的方 法得到较好的效果,这不仅大大缩短了超速离 6时间,节省了氯化艳用量,同时对大小质粒 DNA的纯化均可适用。     

一株奥奈达希瓦氏菌烈性噬菌体的分离、纯化及鉴定

【目的】从环境中分离获得希瓦氏菌烈性噬菌体,并对其性质进行研究。【方法】以4株希瓦氏菌为宿主菌,采用双层平板法从污水样品中分离得到奥奈达希瓦氏菌MR-1烈性噬菌体M1;观察噬菌斑特征;利用超速离心法浓缩M1颗粒,进一步用氯化铯密度梯度离心纯化;采用透射电子显微镜观察纯化的M1颗粒;提取M1核酸,通过核酸酶处理分析其核酸类型及结构;绘制一步生长曲线。【结果】噬菌体M1在双层平板上形成圆形的噬菌斑,清晰透明,边缘光滑,直径为2.3 mm-2.5 mm;经电镜观察,噬菌体M1头部呈二十面体,直径约为55 nm,尾长约为170 nm,尾部可收缩,属于肌尾噬菌体科(Myoviridae);通过酶切分析表明噬菌体M1核酸为线形双链DNA;一步生长曲线显示该噬菌体感染后完成一个复制循环所需要的时间约为15-20 min。【结论】噬菌体M1属肌尾噬菌体科,研究结果为后续研究病毒在地球微生物成岩过程中所起的作用提供了实验材料。     

共表达构建呈现人白细胞介素-13抗原肽的Qβ噬菌体病毒样颗粒

目的:构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原肽的Qβ噬菌体病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗。方法:将人IL-13抗原肽经基因重组插入Qβ噬菌体衣壳蛋白(CP)的C端。在BL21细菌中,经IPTG诱导CP及C端接有IL-13抗原肽的CP(CP/IL-13)同时表达。以硫酸铵沉淀及蔗糖密度梯度离心进行VLPs纯化及分析嵌合VLPs的存在,以HPLC分析VLPs纯度,以电镜观察颗粒形态。小鼠经皮下免疫VLPs后采集血清,以ELISA检测人IL-13特异性Ig G抗体水平。结果:重组蛋白CP与CP/IL-13获得成功表达,两者在密度梯度离心中有一致的、与QβVLPs相同的沉降行为,而CP/IL-13单独无Qβ颗粒行为。经纯化获得了高纯度颗粒,嵌合颗粒与Qβ颗粒形态相似。此外,该VLPs疫苗诱导小鼠产生了IL-13特异的抗体应答。结论:利用共表达策略可成功构建呈现人IL-13抗原表位的嵌合VLPs,为以主动免疫方式调控IL-13在疾病中的病理作用,提供了具有临床应用潜能的疫苗形式。     

用硫酸铵沉淀法从液体培养物中纯化噬菌体λDNA

噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽     

噬菌体DNA的快速抽提

介绍一种噬菌体DNA的快速抽提方法.用聚乙二醇沉淀噬菌体颗粒,然后经DEAE纤维素纯化处理和酚抽提.与传统的噬菌体DNA纯化方法相比,改进后的方法方便、快速、经济,可获得高纯度的噬菌体DNA.     

人精细胞基因组DNA的分离提纯方法及其含量测定

虽然很容易从低等脊稚动物、哺乳动物的 一些细胞,甚至鱼的精子中分离得到DNA,但 从哺乳动物精细胞分离DNA则极为困难〔：,”, 直至1988年Bahnak等才提出一个有效的方 法‘习,但费用既高耗时又多,需用超速离心机及 贵重药品氯化艳,故无此仪器的实验室就无法 引用。由于工作需要,我们建立了一个不用超 速离心机的新方法,突破了精子头难破及破后 DNA 又被大量蛋白质紧密缠绕很难分离的双 重困难。     

一种快速简便的噬菌体DNA的抽提方法

噬菌体DNA的制备和纯化是分子生物学研究中极为重要的一环,在基因库和eDNA库的建立,以及DNA克隆和筛选等方面都是不可缺少的。噬菌体DNA的制备可以通过噬菌体感染细菌在琼脂板上繁殖(称为平板法),也可以在液体培养液中繁殖(称为液体法)。平板法多用     

阪崎肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

[目的]以阪崎肠杆菌模式菌株及分离菌株为指示菌,从污水中分离出该菌噬菌体,并对其基本生物学特性进行研究.[方法]以双层琼脂法从污水中分离噬菌体,通过同属和同科参考菌株测定噬菌体的特异性和宿主谱;电镜观察噬菌体颗粒形态;随机扩增多态性DNA(RAPD)实验分析噬菌体的分子生物学特性.[结果]从污水中分离得到5株噬菌体,表现出较窄的宿主范围,仅裂解阪崎肠杆菌,以ATCC 51329分离的噬菌体SK2可裂解27株阪崎肠杆菌中的24株(89%),负染经电镜观察,5株噬菌体都是由多面体头部和尾部组成;随机引物(5′-GAAACGGGTG-3′)扩增DNA分析,5株噬菌体DNA明显不同.[结论]分离出的5株噬菌体仅对阪崎肠杆菌敏感,在阪崎肠杆菌的分型、预防、治疗、以及生态环境的净化等方面具有潜在用途.     

短小芽孢杆菌缺陷噬菌体

经丝裂霉素c诱发和CsCl密度梯度离心,得到了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)噬菌体PPO。该噬菌体具有典型的20面体的头部,长而可收缩尾鞘的尾,尾鞘的下端附有基板及尾丝。噬菌体DNA的限制核酸内切酶酶切电泳及其与宿主基因组DNA之间的分子杂交结果证明,噬菌体PPO颗粒内包裹的是寄主DNA,因而它是一缺陷噬菌体。     

用改进的十六烷基溴化铵法提取顽拗性种子DNA

近年来，随着种子生理研究的深入，有时需要从顽拗性种子中提取高纯度的DNA或RNA来进行一些重要基因的克隆和表达研究。但由于这类种子大多富含酚类物质”’，用常规的酚／氯仿法提取DNA时很难将它们除去。因为酚类物质的干扰，所得的DNA不能被限制性内切酶彻底水解，也不能进行后续的Southern杂交和基因克隆步骤。尽管用氯化绝密度梯度离心的方法可能会克服这一问题，但这一方法费时、费力，且受超离心条件的限制，有些实验室还不能采用。因此，我们在反复试验的基础上，建立了适于富含酚类植物材料DNA纯化的CTAB（cetrylmethylam…     

一株沙门氏菌裂解性噬菌体的分离鉴定及生物学特性

【目的】从贝类样品中分离到一株沙门氏菌裂解性噬菌体SLMP1,对其进行鉴定及生物学特性分析。【方法】采用双层平板法从贝类样品中分离沙门氏菌噬菌体SLMP1,观察噬菌斑特征,分析SLMP1的宿主范围;利用聚乙二醇8000沉淀浓缩SLMP1颗粒,用氯化铯等密度梯度离心纯化;采用透射电子显微镜观察纯化的SLMP1颗粒;采用酚-氯仿法提取SLMP1核酸,通过核酸酶处理分析核酸类型;分析SLMP1的热稳定性、pH稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线及裂菌效果。【结果】SLMP1噬菌斑直径约2–3 mm,圆形透明、边缘清晰;SLMP1能裂解肠沙门氏菌肠亚种和鼠伤寒沙门氏菌;SLMP1头部呈二十面体,直径约62 nm,含非收缩性尾部,尾长约110 nm,属于长尾病毒科;SLMP1核酸为双链DNA;SLMP1在30–60 °C稳定,在pH 4.0–11.0稳定,最佳感染复数为0.001,感染宿主菌潜伏期为10 min、裂解期为120 min、裂解量为51;SLMP1在液体环境中具有良好的裂菌效果。【结论】SLMP1属dsDNA长尾科裂解性噬菌体,具有沙门氏菌生物抑菌剂的应用潜力。     

裂解型布鲁氏菌噬菌体的分子特征研究

目的:研究布鲁氏茵噬茵体Tb(Tbilisi)的形态学和分子生物学特征.方法:采用透射电镜观察噬茵体颗粒形态,双层琼脂法观察噬斑形态,梯度密度离心纯化噬茵体颗粒,提取噬茵体基因组,采用多种限制性内切酶(S1,DNase I,RNase A,BamHI)对基因组进行酶切琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE观察噬茵体颗粒全蛋白片段.结果:Tb噬茵体电镜下显示头部直径为57±2nm,短尾(32±3mm长),分类学属于短尾噬茵体科.培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2～3mm.核酸结构分析均表明Tb噬菌体基因组为线性dsDNA分子.基因组DNA经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,分子量在34.5kb左右.SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白.结论:该研究证实了Tb噬菌体属于短尾病毒科噬菌体,对宿主菌存在裂解效应并产生2～3mm清晰透亮形态的噬斑,基因组为dsDNA分子,全蛋白包含9条主要的结构蛋白.该研究结果为布鲁氏菌噬菌体的分子水平的研究提供了新的研究基础.     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围…     

动物线粒体DNA的快速制备及鉴定

继Nass和S. Nass (1963-1965）以鸡胚为 材料证明了线粒体中含有DNA,并与核DNA 有所不同之后,有关动、植物的线粒体DNA (mtDNA）的研究迅速开展起来。但就mtDNA 的制备方法而言,当今仍是经典的氯化艳密度 梯度离心法〔41,其它还有Borst16,及Zasloff",等 方法。但这些方法所用仪器与试剂比较昂贵, 现在国内的一般实验室中是不易推广应用的。 如何在有一限的条件下,依据实验的目的和要求, 快速、简便地制备出所需的mtDNA,这便是我 们开展有关研究的第一步。通过我们近来对制 备mtDNA的有关方法的摸索和比较试验,筛 选到一种能快速。简便地制备动物mtDNA的 方法,采用Se恤arose 4B柱纯化,可得到较高纯 度的mtDNA o     

一种简便快速提取和透析昆虫杆状病毒DNA的方法

经几次蔗糖梯度离心纯化的多角体病毒或颗粒体病毒,在0.05MNa_2CO_3-0.01M EDTA-0.17M NaCl(pHl0.9)的碱解液中碱解之后,直接用苯酚抽提,乙醇沉淀DNA,DNA在照有透析膜的Enpendorf离心管内以TE缓冲液透析,这样提取的DNA用凝胶电胶检查仅为单一DNA带,其2600D/2800D的比值为1.82。     

鱼肝线粒体DNA的简易提纯方法

本文报道一种简易分离纯化线粒体DNA(mtDNA)的方法。即以差速离心或蔗糖梯度离心制得线粒体后,用RNase除去RNA,可得纯mtDNA,或用凝胶过滤、或低熔点琼脂糖法纯化之。所获纯mtDNA可用于限制性酶切图谱的组建和其片段的克隆。此法可避开冗长的昂贵的超速离心,故可为普通实验室所采用。文中还讨论了mtDNA纯化和得率的因素。