基于双荧光和单荧光探针的溶酶体pH值测定方法比较

目的:通过比较基于双荧光探针和单荧光探针的2种溶酶体pH值测定方法,探究一种不依赖四甲基若丹明(TMR)的、基于异硫氰酸荧光素(FITC)单荧光的检测溶酶体pH值方法的可行性。方法:利用人肺癌肺泡基底上皮来源的A549细胞,分别采用FITC/TMR双荧光探针法和FITC单荧光双激发法测定溶酶体pH值;通过计算相对荧光强度的比值FI_(FITC488)/FI_(TMR561)或FI_(FITC488)/FI_(FITC405),绘制pH值标准曲线,用于pH值测定。结果:相对于FITC在Ex488 nm/Em520 nm波长下的荧光强度对pH值极为敏感,其在Ex405 nm/Em422 nm波长下对pH值不敏感,可用于荧光矫正;不同pH值条件下,FI_(FITC488)/FI_(FITC405)比值基本呈线性关系。结论:FITC单荧光双激发法只须使用一种荧光探针即可实现pH值检测,较FITC/TMR双荧光探针法更不易产生系统误差,更适用于溶酶体pH值检测。     

辣椒素的荧光分析方法研究

荧光分光光度法可用于辣椒及高纯度辣椒素样品中辣椒素的定量分析。在Ex为278 nm,Em为312 nm荧光条件下,辣椒素在0.58-5.8μg/mL浓度范围内其浓度C(μg/mL)与荧光强度I具有良好线性关系,回归方程c=1.0377×10-3I-0.3667,R=0.9994,精密度RSD=0.08%(n=5)。平均回收率95.39%。     

一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999,P<0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点。     

肽链及蛋白质N-末端喹喔啉类荧光衍生物的形成

蛋白质及肽链N-末端经Dixon转氨后的羰酰基与邻苯二胺作用可形成喹喔啉类荧光衍生物.形成这一发色团的过程较为缓慢;喹喔啉短肽的激发(Ex 293-305nm)与发射(Em 360-365nm)波长随肽链氨基酸残基组成不同而有一定变化;喹喔啉胰岛素荧光衍生物的激发光波长为Ex318nm,发射波长为Em 353nm.喹喔啉三肽的荧光在乙二醇溶液中的变化因其氨基酸残基组成的不同而有差异.以上结果提示:喹喔啉类荧光衍生物可能作为研究蛋白和肽结构与功能的一种手段.     

氮沉降对杉木人工幼林土壤溶液可溶性有机物质浓度及光谱学特征的影响

为探究氮沉降对亚热带杉木人工幼林土壤溶液可溶性有机物质(DOM)浓度及光谱学特征的影响,采用负压法,对0～15和15～30 cm土层土壤溶液DOM进行了2年的动态监测及光谱学特征研究.结果表明:氮沉降显著减少了各土层土壤溶液可溶性有机碳(DOC)浓度,增加了芳香化指数(AI)及腐殖化指数(HIX),但对可溶性有机氮(DON)无显著影响.土壤溶液DOM浓度存在明显的季节变动,夏秋季显著高于春冬季.傅里叶红外光谱结果表明,森林土壤溶液DOM在6个区域的相似位置存在吸收峰,其中1145～1149 cm^-1的吸收峰最强.三维荧光光谱表明,DOM主要以类蛋白质物质(Ex/Em=230 nm/300 nm)和微生物降解产物(Ex/Em=275 nm/300 nm)为主,施氮使0～15 cm土层类蛋白质物质减少.氮沉降可能主要是通过降低土壤pH、抑制土壤碳矿化和刺激植物生长等途径显著抑制土壤溶液DOC浓度,而表层被抑制的DOC成分以类蛋白质物质和羧酸盐物质为主.氮沉降短期可能有利于土壤肥力的储存,但随着氮沉降量的积累,土壤中营养物质将难以得到有效利用.     

昆虫体内多胺的高效液相色谱(HPLC)测定

建立丹磺酰氯柱前衍生HPLC快速测定昆虫体内多胺含量的方法。以C18(250mm×4.6mm,5μm)为固定相,甲醇和水为流动相,梯度洗脱,柱温40℃,流速1mL/min,荧光检测波长激发波长(Ex)280nm,发射波长(Em)515nm,测得腐胺(put)、亚精胺(spd)和精胺(spm)三者回收率分别为98.7%,99.2%和97.8%,回归方程线性良好(r值均大于0.99),分析时间为16min。该法简洁、快速、灵敏度高、重现性好,可有效分析昆虫及其他生物样品中微量多胺的含量。     

酵母GAPDH在碘化钾溶液中荧光发色团的形成

酵母GAPDH的剩余活力在碘化钾为0.1M溶液中趋近于零,内源荧光在碘化钾为0.1—0.4M时迅速被淬灭,在0.5—2.0M时基本不变,3.0M时达到最低。并在一定浓度的碘化钾溶液中形成新的荧光发色性质(Ex336nm;Em383nm),量子产率大约为0.2,但形成该荧光发色团较为缓慢。与NAD荧光衍生物(Chen-LuTsou,etal.(1983)Biochem.Soc.Trans.11,425—429)不同的是,GAPDH在碘化钾溶液中形成荧光发色团时不需要光的激发。肌酸激酶及胰岛素不形成这种荧光衍生物。     

糯和非糯水稻籽粒发育过程中内源多胺的变化

本试验按Ma等的内标法(internal standard,InProceedings of Fourth Asian Chemical Congress.August,1991.Beijing)进行衍生提取测定,衍生化样品在高效液相色谱(HPLC)u-Bondapak NH_2(100μm3.9×300nm)柱进行分析,荧光检测(Ex=338nm,Em=495nm),峰面积积分定量。分析测定两对水稻(Oryzasativa)糯性等基因系原丰早和糯原丰早、广陆矮4号和糯广陆矮4号开花后7～30d期间,籽粒中腐胺(Put)、尸胺(Cad)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)4种多     

薄层色谱-荧光分光光度法测定淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量

目的 :建立了薄层色谱 荧光分光光度法测定淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量。方法 :用 70 %乙醇水浴回流提取 ,用醋酸丁酯 甲酸 水 (1.3∶1∶1)在 10℃以下放置后的上层溶液为展开剂 ,展开 ,分离淫羊藿苷 ,在Ex=4 30nm ,Em=4 80nm条件下测定荧光强度。结果 :线性范围为 0 .8～ 4 .8μg ,相关系数r =0 .9973,平均回收率 97.4 8%。结论 :此法简单、灵敏、准确 ,重现性好。     

肽链及蛋白质N-末端羰酰荧光衍生物的形成

短肽及胰岛素的N-末端经Dixpn转氨后具有荧光发色性质,其激发与发射波长随肽链氨基酸残基的种类和数量的不同而有差异,其范围大约为Ex 312—333nm;Em 398—408nm;量子产率为0.020—0.03.荧光发色团的基本化学结构可能是N-末端α-羰酰基及其相连的酰胺基,并且N-末端第二及第三位氨基酸残基对其荧光性质有影响.在碱性溶液中(pH>9.0)它的荧光强度降低,但在NaCl溶液中随盐浓度的增加而增强.在不同浓度的CuHCl溶液中,羰酰三肽的荧光强度变化随其氨基酸残基的种类和构型的不同而有差异.以上结果提示;α-羰酰荧光衍生物可能作为蛋白及肽N-末端的荧光探剂,可能成为研究蛋白和肽结构与功能的一种手段.     

低分子肝素的绿色荧光蛋白荧光标记及其活性检测

增强型绿色荧光蛋白（EGFP）是生物领域常用的标记物. 本实验首先利用高碘酸法活化低分子肝素（LMWH）,与EGFP连接得到LMWH EGFP.然后用Sephacryl S-200 HR对其进行初步分离,再用Sephadex G-10 HR进行脱盐纯化. 采用Sephacryl S 200 HR检测LMWH EGFP的纯度,为单一对称峰. 经检测,LMWH-EGFP具有良好的热稳定性和耐碱性. 通过荧光分光检测器检测LMWH-EGFP的λEx为488 nm,λEm为509 nm. 通过抗凝实验发现LMWH EGFP仍具有抗凝活性. 本实验建立了LWMH荧光标记的方法,为多糖的荧光标记提供了新的选择.     

以EV71 3Cpro为靶标的抗病毒药物筛选模型的建立及抗3Cpro化合物筛选

建立一种以EV71 3C蛋白酶为靶标的抗肠病毒药物筛选模型,并应用于小分子化合物库筛选具有抗EV71活性的化合物.从临床手足口病例标本中分离肠道病毒进行PCR鉴定及基因组测序.通过插入突变在黄色荧光YFP编码框合适位点处引入EV71 3C酶切位点,构建对3C蛋白酶敏感的报告质粒pc DNA3-m YFP,然后将其与表达3C的质粒共转293A细胞,在3C抑制剂Rupintrivir存在与否的情况下通过荧光显微镜和酶标仪检测Ex(500nm)/Em(535nm)荧光信号的变化,判断建模是否成功;利用建好的筛选模型在高通量药物筛选平台对小分子化合物库进行初筛和复筛;再利用空斑分析检测筛选出的活性化合物是否对临床分离的EV71毒株具有抑制作用.m YFP在293A细胞中表达良好,3C的表达使荧光信号下降80%,Rupintrivir的存在则几乎不影响荧光表达,说明以3C为靶位的筛选模型构建成功.经过高通量初筛和复筛从26 000多种小分子化合物中获得26种能够显著回复m YFP表达的活性化合物;空斑分析显示其中2种化合物具有较为明显的抑制EV71复制的活性.因此,我们所构建的3C-m YFP共表达系统是一种简便有效的、可用于高通量筛选抗EV71 3C~(pro)药物的筛选模型.     

褐藻裙带菜色素蛋白复合物的性质*

用去污剂DMG增溶褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)的类囊体膜,通过PAGE分离色素-蛋白复合物并分析其性质,结果表明:CPⅠa和CPⅠ都含有66kDa的多肽,低温荧光发射光谱中有715nm的长波荧光峰,激发光谱测定结果表明CPⅠa是含有墨角藻黄素的叶绿素a/c-蛋白复合物,CPⅠ是只含有叶绿素a的色素-蛋白复合物。CPa含有51、37、34和20kDa四种多肽,低温荧光发射峰位于683nm,激发光谱表明它含有叶绿素a、c和少量墨角藻黄素,是裙带菜的PSⅠ复合物。其余5条为捕光色素-蛋白复合物,它们都是由20kDa的多肽组成,其中LHC₁和LHC₃有相似的光谱特性,是墨角藻黄素-叶绿素a/c-蛋白复合物,LHC₂、LHC₄和LHC₅的光谱特性相似,是叶绿素a/c-蛋白复合物。     

中国南瓜海南农家品种间的遗传特异性分析和DNA指纹图谱构建

在收集中国南瓜海南农家品种的基础上,本研究应用ISSR和SRAP标记技术对28份海南农家品种间的遗传特异性进行了分析,并构建指纹图谱,为中国南瓜海南农家品种鉴定、评价、保护和利用提供科学依据。结果表明,所供试的品种间存在显著的遗传特异性,具有特殊的遗传基础或背景,所筛选的6个ISSR引物和11对SRAP引物共产生了10个特异标记和11条唯一缺失带;应用ISSR引物组合UBC807/UBC814/UBC844/UBC868和UBC808/UBC814/UBC844/UBC868,以及SRAP引物组合Me1/Em2 Me1/Em10 Me2/Em3和Me1/Em1 Me1/Em10 Me8/Em3分别绘制了四张28份中国南瓜海南农家品种的DNA指纹图谱,所构建的DNA指纹图谱直观、简单。ISSR标记和SRAP标记技术可有效应用于中国南瓜海南农家品种DNA指纹图谱的构建和遗传特异性鉴定。     

藻胆体核亚基ApcD定点突变及体内重组功能研究

在对Anabaena sp.PCC7120藻胆体核亚基ApcD结合色素PCB的体内重组中,发现色素蛋白在提纯前后最大吸收峰和荧光峰发生了红移,从提纯前的605nm及633nm变为提纯后的650nm及665nm.为了研究该现象的原因,构建了ApcD的8个突变体,重组结果显示:突变体ApcD(Y88I)色素蛋白在提纯后的吸收光谱和荧光光谱较提纯前均多出一个峰,分别为668nm,690nm;ApcD(W59Q)、ApcD(Y73A)、ApcD(W87E)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱一致;ApcD(M126S)、ApcD(Y116S)、ApcD(M160T)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱一致,而提纯后的荧光峰位置较提纯前分别红移了5nm、7nm和10nm;ApcD(M115I)色素蛋白在提纯前后的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移,从提纯前的605nm和633nm变为提纯后的638nm和655nm.这些色素蛋白在酸性尿素溶液变性条件下的最大吸收峰始终在662nm,表明辅基色素仍然是藻蓝胆素;在对PCB-ApcD、PCB-ApcD(Y116S)及PCB-ApcD(M160T)的圆二色谱分析发现,该两个氨基酸的突变均...     

橙色荧光蛋白——绿色荧光蛋白GFPxm的改造

最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因。经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白 (GFPxm)具有 4 76nm的激发峰和 4 96nm的发射峰 ,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用。这里进一步报道GFPxm的 12种突变型。在大肠杆菌中的表达结果表明 ,有 7种突变型在 37℃条件下产生高的荧光强度。在 2 5、32和 37℃条件下表达 6h ,GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) ,而GFPxm16和GFPxm16 3在 4 2℃高温表达时仍能保持高的荧光强度。这 7种突变型中的 4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达。此外 ,有 6种突变型的荧光光谱红移 ,目前所达到的最长激发峰为 5 14nm、最长发射峰为 5 2 5nm。另外有 3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰 ,1种突变型只有单一的紫外激发峰。首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm ,它的激发峰为 5 0 9nm、发射峰为 5 2 3nm。 5 2 3nm属于黄绿色 ,但肉眼看到的蛋白为橙色。OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟 ,但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低。     

NT-pro BNP与LAVI对原发性高血压患者左心室舒张功能的评价

目的:应用左房容积指数(LAVI)与血清N末端脑钠肽原(NT-pro BNP)水平的变化情况评价原发性高血压(EH)患者左心室舒张功能。方法:选择2013年5月-2015年5月在我院接受治疗的原发性高血压患者100例。根据左房舒张功能将患者分为A组(E/A1,且Em/Am1)、B组(E/A1,且Em/Am1)、C组(E/A1,且Em/Am1)及D组(E/A2,且Em/Am1),。另选取同期在我院接受体检的健康志愿者100例作为对照组。观察并比较各组LAVI及NT-pro BNP水平,分析LAVI与及NT-pro BNP与原发性高血压患者左心室舒张功能的相关性关系。结果:原发性高血压患者E/A、LAVI及NT-pro BNP水平均显著高于对照组,而Em/Am则低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);原发性高血压患者中,LAVI及NT-pro BNP水平随E/A升高而递增,随Em/Am升高而递减,其中D组LAVI及NT-pro BNP水平显著高于其他三组,差异均具有统计学意义(P0.05)。根据Pearson相关性分析可知结果显示,原发性高血压患者LAVI与NT-pro BNP呈正相关关系(P0.05),但与E/A及Em/Am无明显相关关系(P0.05)。LAVI的截断值为29.040,NT-pro BNP为2.065时评价左室舒张功能存在异常的敏感度及特异度均较高(P0.05)。结论:LAVI及NT-pro BNP可较好地评价EH患者左室舒张功能情况,且:LAVI及NT-pro BNP二者之间联系紧密与原发性高血压存在一定的相关性,两者均能较为准确的评价原发性高血压患者的左心室舒张功能,值得在临床给予推广应用。     

钝顶螺旋藻形态、生长及光合作用对不同波段太阳辐射的响应

为探讨中不同波段的光合有效辐射对钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)形态、生长及光合作用的影响,实验将钝顶螺旋藻D-0083藻液转入带塞的石英管中, 石英管水平置于阳光下并在其上覆盖不同的截止型和带通型滤光片, 以使藻丝接受不同波段的太阳辐射; 并检测其生长、形态与光合活动的变化。结果发现: 所有波段 (320500、395700、510700和610700 nm) 光合有效辐射下的藻丝均螺旋变紧且生物量增加。其中以包含少量紫外辐射A (Ultraviolet-A)的蓝光波段 (320500 nm)和红光波段(600700 nm) 对藻丝形态变化、生长及光合速率的诱发效率较高。在320500、395700、510700和 610700 nm波段上的单位能量光照引起钝顶螺旋藻螺距变化的效率分别为0.070、0.015、0.021、0.045 m/(Wm2)。 波段320500 nm虽然会轻微抑制钝顶螺旋藻D-0083的有效光化学效率(Fv'/Fm')、电子传递速率(ETR)和藻蓝蛋白的荧光发射, 但是却能够有效诱导其藻丝变紧促进生长。此外, 钝顶螺旋藻D-0083的藻丝变紧程度、比生长速率变化与不同波段太阳辐射下藻丝体的光合性能相一致。该研究表明任何波段的光合有效辐射都能使螺旋藻藻丝螺旋变紧并引发生长和光合作用, 其中以蓝光和红光的效率最高。     

白藜芦醇通过调节SIRT1/NF-κB通路减轻力竭训练致大鼠肾的炎症反应

白藜芦醇是天然存在的沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1,SIRT1)小分子激动剂,其肾的保护作用已在多种肾疾病动物模型中得到了验证。然而,白藜芦醇是否能够改善力竭训练导致的大鼠肾损伤,以及是否通过SIRT1/NF-κB信号通路调节运动性肾损伤大鼠肾炎症反应,尚缺乏系统研究。本研究将32只SD大鼠随机分为安静对照组(Con组),白藜芦醇组(Rsv组),力竭运动组(Ex组),力竭运动+白藜芦醇组(Ex+Rsv组)。Rsv和Ex+Rsv组每天灌胃50 mg/kg体重剂量的白藜芦醇, Ex和Ex+Rsv组进行4周力竭训练,最后1次训练后24 h取材。本研究结果显示,与Con组相比,Ex组大鼠Scr(175.66±16.08 vs.153.34±8.67,P0.01)、BUN(6.67±0.53 vs.5.37±0.19,P0.01)和尿NGAL(9.01±0.18 vs.7.48±0.31,P0.01)水平均显著升高,Ex组大鼠肾组织NF-κB P65在蛋白质水平表达显著升高(0.77±0.10 vs. 0.27±0.03,P0.01);各组大鼠肾组织SIRT1在蛋白质水平表达上,Rsv组显著高于Con组(0.90±0.14 vs. 0.43±0.15,P0.05),Ex+Rsv组显著高于Ex组(1.0±0.28 vs. 0.38±0.12,P0.01);与Ex组相比,Ex+Rsv组大鼠肾组织NF-κB P65(0.57±0.13 vs. 0.77±0.10,P0.05)和Ac-NF-κB P65(0.52±0.13 vs. 0.78±0.11,P0.05)在蛋白质水平表达显著降低。以上结果表明,4周大强度力竭运动导致大鼠出现运动性肾损伤,并激活大鼠肾NF-κB的表达。白藜芦醇可显著提高大鼠肾组织SIRT1在蛋白质水平的表达,并增加脱乙酰化作用,降低NF-κB P65蛋白质乙酰化修饰水平,进一步降低NF-κB的表达。白藜芦醇减轻力竭训练致大鼠肾的炎症反应的机制可能与SIRT1/NF-κB通路有关。     

测定植物胞内游离钠离子的研究进展

植物耐盐机制的研究一直是植物抗性研究的焦点。近年来,随着生物学不断发展和新荧光标记技术的运用,胞内钠离子测定逐渐应用于植物盐胁迫研究中。该文论述了以下三方面问题:(1)分别介绍了SBFI、Sodium Green和Coro Na Green三种钠离子荧光指示剂:SBFI是一种双激发波长指示剂,其激发波长是340 nm/380 nm,发射波长是500 nm;Sodium Green和Coro Na Green是单波长指示剂,其激发波长分别是507 nm和492nm,发射波长分别是532 nm和516 nm;(2)比较了酯导入、酸导入、电穿孔和显微注射等几种常见荧光指示剂载入胞内方法的优缺点,重点介绍了一种无损伤低温抑制酯酶法:先将荧光指示剂在缓冲液中低温(4℃)处理2 h,随后回到常温(20℃)在不含荧光指示剂的缓冲液中孵育2 h;(3)阐述了胞内离子浓度计算公式,包括单波长测定公式、双波长比率测定公式。