溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株的构建及其表型特征

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【结果】成功构建溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株。体外实验表明,kdpD的缺失对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性试验结果显示,突变株毒力下降了8.84倍。【结论】kdpD基因参与调控溶藻弧菌的泳动能力、被膜形成和毒力,但不影响生长速率和胞外蛋白酶活性。     

溶藻弧菌溶血活性检测及溶血素基因、启动子区功能

[目的]研究溶藻弧菌的溶血现象,溶血素基因vah的分布及vah基因、vah启动子区对溶藻弧菌溶血活性的贡献.[方法]对46株分离自华南沿海水生动物体内和海水的溶藻弧菌环境株及溶藻弧菌标准株1.1587进行溶血实验;比较具有溶血活性的溶藻弧菌野生株ZJ051、vah基因大肠杆菌BL21重组表达株、vah缺失突变株和基因回补株间溶血能力的差异;检测vah基因在溶藻弧菌中的分布,比较溶血株与非溶血株vah基因及上游启动子区的序列差异.[结果]47.8％的溶藻弧菌菌株产生溶血活性,因此溶血现象普遍存在于溶藻弧菌环境株中;vah基因的表达产物具有溶血活性,vah基因缺失突变株不具有溶血活性,而vah基因回补株恢复溶血活性.vah基因普遍存在于溶藻弧菌中,且基因序列非常相似,氨基酸序列完全相同,然而不同菌株的启动子区第188-190碱基位点存在差异.[结论]溶藻弧菌vah基因是造成溶藻弧菌溶血的直接原因,但溶藻弧菌溶血能力的差异并非是由vah基因本身差异决定,极有可能与启动子区第188-190碱基位点相关.     

拟态弧菌金属蛋白酶基因PrtV缺失株的构建及生物学特性分析

【背景】研究发现PrtV基因编码含多囊肾病(polycystic kidney disease)结构域的金属蛋白酶,其在多种细菌的致病过程中具有重要作用。拟态弧菌是一种感染多种水生动物的重要病原菌,PrtV基因在拟态弧菌致病中的作用尚不清楚。【目的】探究PrtV基因对拟态弧菌致病相关生物学特性的影响。【方法】采用自然转化的方法构建拟态弧菌PrtV基因缺失株(ΔPrtV),同时通过基因与质粒重组后电转化导入缺失株构建回补株(ΔPrtV/pPrtV),对突变株的生长特性、生化特征、生物被膜形成、自聚集能力、胞外产物卵磷脂酶和蛋白酶活性,以及致病性和细胞毒性等进行分析。【结果】与野生株相比,缺失株的生长特性、生物被膜形成、自聚集能力和卵磷脂酶活性无变化,但分解尿素、甘氨酸、香豆酸盐、鸟氨酸和赖氨酸的理化特性改变;胞外产物蛋白酶活性显著降低(P<0.05),细胞毒性显著下降(P<0.05),对杂交鲇的致病力下降10倍。【结论】PrtV基因与拟态弧菌的细胞毒性及致病性等多种生物学特性有关。该结果为进一步解析拟态弧菌PrtV基因功能及其致病机制提供了依据。     

溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg23535基因突变株的构建及其功能初探

【背景】小RNA被证实对细菌遗传变异、生长繁殖、致病性等具有重要的调控作用,但是在机会致病菌——溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)中研究较少。本实验室前期通过转录组测序和Northern Blot鉴定得到溶藻弧菌ZJ-T中小RNA srvg23535。【目的】初探小RNA srvg23535对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】利用同源重组技术构建小RNA srvg23535的缺失突变株,并对野生株和srvg23535突变株的菌落形态、运动性、胞外蛋白酶分泌、H_2O_2和Cu~(2+)的压力感应、铁吸收利用、抗生素抗性以及生长代谢等生物学特性进行比较研究。【结果】通过对溶藻弧菌小RNA srvg23535基因缺失突变株的生物学特性分析表明,小RNA srvg23535缺失后,对溶藻弧菌菌落形态、运动性、胞外蛋白酶分泌、H_2O_2和Cu~(2+)的压力感应、铁吸收利用、抗生素抗性以及多数测定的碳源、氮源代谢的影响不显著;但突变株对D-海藻糖(D-trehalose)的代谢减弱,对果胶(Pectin)、丙氨酸-谷氨酰胺(Ala-Gln)的代谢增强,并可利用丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)为氮源。【结论】小RNA srvg23535参与调控溶藻弧菌对D-海藻糖(D-trehalose)、果胶(Pectin)、丙氨酸-谷氨酰胺(Ala-Gln)和丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)的代谢,这将为获取srvg23535调控靶标基因,进而阐明其与靶标基因的相互作用机制奠定基础。     

玉米弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建及致病力分析

利用农杆菌介导的基因转化(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)技术,转化玉米弯孢叶斑病菌 (Curvularia lunata),共获得转化子1 454个。对其中菌落形态、生长速率等性状有显著变化的8个突变株进行分析。通过离体叶片接种进行筛选,发现4个突变株致病性降低,2个突变株致病性增强。通过测定生长速率、产孢量及细胞壁降解酶活性发现,其中致病性减弱的突变株,其产孢量均有所下降甚至不产孢,突变株的PG酶活性普遍增强,但Cx酶活性没有明显变化,而2株强致病性突变株的Cx酶活性明显增强。     

溶藻弧菌VcrV基因缺失株的构建及生物学特性

为研究溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统VcrV基因的功能和生物学特性,采用同源重组技术成功构建了溶藻弧菌缺失株ΔVcrV,并用PCR检测其遗传稳定性。结果显示,缺失株遗传稳定;与野生株相比,生长和自凝集能力无显著变化;但生物膜形成能力降低,半致死剂量升高16.5倍;游动性和涌动性极显著升高,细胞粘附能力极显著降低(P<0.01),对H₂O₂和NaCl的耐受性降低;对头孢呋辛、麦迪霉素、克林霉素抗生素敏感度上升,对丁胺卡那、多粘菌素B抗生素敏感度降低;活性氧含量极显著降低(P<0.01),脯氨酸、肽聚糖、β-内酰胺酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶指标均极显著升高(P<0.01)。缺失株生物学特性表明,VcrV基因参与溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统性的致病性和多种生物学功能。     

溶藻弧菌的毒力相关基因及其对小鼠的致病力

【目的】通过多重PCR检测和小鼠动物实验,对溶藻弧菌环境分离株的毒力因子进行评估,以期获得较强致病菌株和弱致病菌株之间的差别,并初步探讨该菌毒力因子对小鼠的致病机理。【方法】采用多重PCR体系检测毒力相关基因,我妻氏血平板溶血实验和平板酶活实验检测溶藻弧菌株的溶血素和胞外酶;以昆明小白鼠为实验动物,攻毒方式为灌胃和腹腔注射,根据小鼠的致病症状和死亡情况来分析和对比溶藻弧菌的胞外分泌物以及菌体本身的毒性。【结果】10株溶藻弧菌产淀粉酶、卵磷脂酶的比例为100%,脂肪酶、明胶酶次之(为70%),脲酶均未被检出;神奈川现象阳性菌株率为60%。毒力基因检测的结果显示10株溶藻弧菌中toxR、Collagenase、tlh、FlaA、ompW、AspA、fur这些与毒力有关的基因均有分布,而toxS、trh、tdh、UreR并未检出。10株溶藻弧菌中的VA009对小鼠显示了较强的致病性,能造成腹腔积液,经腹腔注射感染此菌后7 d内死亡率高达80%。【结论】不同的溶藻弧菌对小鼠的致病性存在较大差异,溶藻弧菌菌体本身比胞外分泌物对其毒性的贡献要大,而副溶血弧菌的毒性则由其胞外分泌物起主要作用;比较我们筛选出的强致病菌株与弱致病菌株,其上述毒力基因的分布并没有差别,说明溶藻弧菌可能存在一套与副溶血弧菌不同的独立的毒力基因系统。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。     

假单胞菌M18调控基因ppbR的克隆及功能研究

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素.根据生物信息学分析,铜绿假单胞菌PA2572基因编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子.本研究从假单胞菌M18基因组中扩增出PA2572同源基因片段ppbR,利用体外定点插入突变和同源重组技术构建了M18的ppbR突变株M18P.研究结果表明,突变株M18P在泳动能力和群集运动能力上有显著的下降.突变株合成PCA的能力比野生型有显著的下降,在发酵液中PCA积累量仅为野生型的50%.在KMB培养基中,突变株Plt的积累量和野生型没有显著的差异.     

假单胞菌M18调控基因ppbR的克隆及功能研究

假单胞菌 (Pseudomonas sp.) M18 是促进植物生长的根际细菌, 能产生吩嗪-1-羧酸 (PCA) 和藤黄绿菌素 (Plt) 两种不同的抗生素。根据生物信息学分析, 铜绿假单胞菌PA2572基因编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子。本研究从假单胞菌M18基因组中扩增出PA2572同源基因片段ppbR, 利用体外定点插入突变和同源重组技术构建了M18 的ppbR突变株M18P。研究结果表明, 突变株M18P在泳动能力和群集运动能力上有显著的下降。突变株合成PCA 的能力比野生型有显著的下降, 在发酵液中PCA积累量仅为野生型的50%。在KMB培养基中, 突变株Plt的积累量和野生型没有显著的差异。     

铜绿假单胞菌泳动能力相关新基因的筛选及鉴定

从Mu转座突变子文库中经过表型筛选,得到12株泳动(Swimming motility)能力缺陷的突变子,经Mu转座子插入位点的确认、基因克隆及测序分析发现其中10个突变子中Mu转座子分别插入到10个不同的与鞭毛运动和功能相关的基因中,2个突变子中Mu转座子插入到功能未知的新基因(PA2950和PA5022)中,电镜观察结果表明这2个突变株均具有完整的鞭毛,初步推测这2个基因可能是参与鞭毛泳动的能量代谢、趋化作用或信息传递的新基因。     

Tn5介导的致病性副溶血弧菌溶血能力差异突变株表型分析

【目的】构建致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)突变体库,分析溶血能力差异突变株表型特征,为深入挖掘和认识tdh的调控机制提供研究基础。【方法】利用双亲本接合法,将Mini-Tn5-Km2片段随机插入致病性Vp (ATCC 33846)基因组,并以含有卡那霉素(Km)和氨苄青霉素(Amp)的TCBS选择性培养基进行突变株(KmRAmpS)筛选;结合PCR方法对突变菌株进行Km基因筛查,构建在不同基因位点随机插入突变的Vp突变体库。以我妻氏血平板筛选溶血表型变化菌株,并对其生长曲线、菌膜形成能力和运动能力进行测定。【结果】采用双亲本接合法,成功建立包含490株Vp突变株的突变体库,并获得5株溶血表型变化稳定的菌株(2株为溶血能力上调,3株为下调)。5株突变株在生长速率、菌膜形成能力及运动能力方面与亲本株有显著性差异。其中,2株溶血能力上调菌株及1株溶血能力下调菌株在运动能力、生长速率和菌膜形成能力方面较亲本株显著降低(P<0.05);另2株溶血能力下调菌株菌膜形成能力较亲本株显著提高(P<0.05)。【结论】Tn5转座子可用于建立Vp突变体库;Vp溶血能力与其表型特征具有相关性;研究所获得的5株溶血表型突变株为进一步探讨Vp tdh的调控机制奠定基础。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株ompH基因敲除突变株的构建及其生物学功能

[目的]探讨ompH基因在禽多杀性巴氏杆菌致病过程中的作用.[方法]利用同源重组原理构建中间为四环素抗性基因,两侧为ompH基因上下游同源序列同源的敲除载体pWSK29△ompH,将敲除载体电击转入C48-3株感受态细胞中,通过四环素抗性和菌落PCR筛选ompH基因的敲除突变株,并通过组合PCR、逆转录PCR和DNA测序对突变株进行验证.用生物学功能实验比较野生株、互补株和突变株在生长速率、荚膜结构、粘着能力和致病性等方面的差异.[结果]组合PCR、逆转录PCR和DNA测序结果证实ompH基因的敲除突变株C48-3△ompH构建成功,电镜观察结果证实ompH基因的缺陷影响细菌的荚膜合成能力,粘附实验结果显示与野生株C48-3和互补株C48-3C相比突变株C48-3△ompH对CEF细胞的粘附能力显著降低(P＜0.01),而小鼠毒力实验结果表明突变株C48-3△ompH的致病性相对减弱.[结论]本实验构建的突变株C48-3△ompH,为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定基础.     

转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因

[目的]生物膜在沙门氏菌的致病性和引起沙门氏菌食物中毒等方面起着重要作用,本研究为了鉴定影响沙门氏菌生物膜形成的基因.[方法]利用结晶紫染色定量法对74株鸡源的肠炎、鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行生物膜测定,选择生物膜生长较好的肠炎沙门氏菌C050041,采用转座子随机插入法构建突变株库.[结果]84%的鸡源沙门氏菌菌株可在塑料表面形成生物膜;通过转座子插入获得1924个突变株,筛选的生物膜降低突变株经生长曲线测定、测序和序列比对及Southern blot分析鉴定出15个插入基因,它们分别为metE、ompR、rpoS、,和G、rfaJ、rfaK、rfaP、rfbH、rhlE、spiA、steB、tpx、ybdN和2个未知功能的基因.[结论]我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究沙门氏菌生物膜形成的调控机制,研制减毒沙门氏菌疫苗奠定了基础.     

胡萝卜软腐果胶杆菌鞭毛钩基因flgK 的功能

【目的】为了研究鞭毛钩基因flgK在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)的功能。【方法】本研究采用两亲同源交换法构建了基因缺失突变体ΔflgKpcc并构建了互补菌株ΔflgKpcc-KH,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病因子、致病性等表型。【结果】与野生菌株PccS1相比,ΔflgKpcc鞭毛缺失,菌体易沉降,在0.3%半固体培养基上运动能力明显降低,生长速率无明显变化,但是纤维素酶和蛋白酶的活性、生物膜形成能力明显下降,对感病寄主的致病力显著减弱。基因互补可以使上述突变表型恢复。【结论】实验表明,鞭毛基因flgK突变导致了菌体的运动性降低、病原菌毒性相关的酶活力下降,从而导致致病力下降。     

溶藻弧菌铁载体合成及外膜蛋白表达的研究

初步研究了海洋动物病原菌溶藻弧菌的铁摄取机制。溶藻弧菌能够在高浓度铁螯合剂2-2二联吡啶的培养基中存活。在限铁环境中,溶藻弧菌生长受到抑制,补加铁可以消除这种抑制作用。通过铁载体定量检测,发现分离于发病鱼体的溶藻弧菌MVP01产铁载体量大于分离于海水的菌株No·1·1587。互补实验证明溶藻弧菌的铁载体粗提物能够被铁载体合成缺陷的大肠杆菌突变株AN93利用。在铁限制培养环境中,溶藻弧菌合成了约80kD铁调控外膜蛋白。铁摄取系统在溶藻弧菌的生存和致病性方面,都有重要的作用。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌E058株毒力基因(aerobactin)与sit操纵子基因突变株的构建及其致病性

[目的]探究毒力基因aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株致病作用的相关性.[方法]利用Red同源重组方法,构建APEC E058株aerobactin与sit操纵子基因缺失株E058Δvir,并通过一系列的体内及体外试验对其生物学特性进行研究.[结果]生长曲线测定、细菌侵袭试验及体外竞争等试验结果表明,突变株与亲本株差异不显著;体内动态分布试验结果显示,突变株E058Δvir在5个被检脏器中均极显著地低于亲本株(P＜0.001).[结论]aerobactin与sit操纵子与禽致病性大肠杆菌E058株的致病性相关,是其重要的致病因子.     

空肠弯曲菌fliD基因突变株的构建及其生物学特性

【目的】研究fliD基因对空肠弯曲菌生物学特性的影响,为阐明该基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】利用同源重组技术构建fliD基因的插入失活突变株NCTC11168△fliD,并通过与野生株比较,对fliD突变株生长速率、运动力、黏附力和侵袭力等生物学特性进行研究。【结果】与野生型NCTC11168相比,突变株NCTC11168△fliD的生理生化特性不变;突变株的生长速率无明显变化;MH半固体穿刺实验中,突变株只能在接种处生长,运动力明显减弱;在Caco-2细胞黏附、侵袭实验中,fliD突变株的黏附率和侵袭率分别为164.00±19.49、55.00±6.09,fliD基因失活使得突变株的黏附率和侵袭率显著降低(0P0.01)。【结论】fliD基因是空肠弯曲菌运动能力重要的分子基础,与空肠弯曲菌感染细胞的黏附侵袭作用密切相关,即与空肠弯曲菌的致病性密切相关。     

多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定

【目的】构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,并验证其致病性。【方法】采用正向筛选同源重组技术构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,利用PCR对突变株进行鉴定,分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。【结果】成功构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,连续传代20代,遗传稳定;突变株体外生长曲线表明,在前6h生长速度稍慢于亲本菌,随后两者生长速度一致。对小鼠的致病性试验表明:经腹腔注射aroA基因缺失突变株在1.0×106 CFU对小鼠无致死性,而亲本菌株在1.0×102 CFU对小鼠是致死性的。【结论】本研究获得多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,对小鼠的致病性是减弱的。多杀性巴氏杆菌突变株的构建有助于研究其致病机理。