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目的:CRISPR/Cas9系统在斑马鱼的反向遗传学中的到了广泛应用,但突变基因的表型观察往往需要在突变鱼系的F1中进行,费时较长。LHX9作为LIM家族的一种转录因子,在胚胎早期的泌尿生殖嵴中有广泛分布;且LHX9基因敲除的小鼠存在性腺发育不良。本研究拟通过一种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术,采用四条sgRNA对LHX9基因进行VASA转基因斑马鱼的基因敲除,以观察该基因缺陷对斑马鱼性腺发育的影响。方法:利用新的CRISPR/Cas9技术,设计四条针对斑马鱼LHX9基因3号外显子的20bp的sgRNA,通过非克隆体外转录得到靶位点的四条sgRNA。将以上靶位点的四条sgRNA与Cas9核酸酶蛋白同时注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,利用PCR鉴定突变型类型和突变比例。通过对LHX9基因突变体的VASA转基因斑马鱼进行荧光观察,发现LHX9基因缺陷的斑马鱼性腺发育的情况。结果:靶向Exon 3的四条sgRNA可成功编辑斑马鱼LHX9基因,敲除效率高达82%,Sanger测序发现产生10种不同的移码突变类型。通过该方法对VASA转基因斑马鱼的LHX9基因进行编辑,发现LHX9基因突变导致dph6的的斑马鱼原始生殖细胞增殖和迁移受到影响。结论:基于4条sgRNA注射的CRISPR/Cas9技术,可以快速地产生具有突变表型的G0斑马鱼,具有应用潜力。LHX9基因敲除导致原始生殖细胞的发育和迁移受到影响,提示该基因参与了斑马鱼早期性腺的发育。 相似文献
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又一次发现小鼠肥胖基因近年来,科学家们已在小鼠体内发现了一些与肥胖有关的基因。美国的EdwardH.Leiter与TurgenK.Naggert等在今年6月的《NatureGenetics》上又报道发现1个有关肥胖的基因,位于第8号染色体上羧肽酶基因... 相似文献
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摘要 目的:探讨smc5基因敲除对斑马鱼肝脏基因表达谱的影响,进一步明确smc5突变对斑马鱼代谢的影响。方法:用CRISPR/Cas9技术构建smc5基因敲除斑马鱼模型,取3个月的smc5-/-和野生型斑马鱼肝脏进行转录组测序,创建基因表达谱文库,观察smc5基因敲除后斑马鱼肝脏基因表达谱的变化,将筛选出的差异表达基因进行功能富集,并运用荧光定量PCR对KEGG通路中显著的差异表达基因进行验证。结果:成功构建出7号外显子上2碱基缺失造成移码突变的smc5基因敲除斑马鱼模型。RNA-seq发现smc5-/-斑马鱼的肝脏基因表达谱变化显著,包含p53的多个通路激活,如细胞周期和凋亡。糖酵解、脂肪酸降解与代谢、丙酮酸代谢等相关通路显著下调。荧光定量PCR结果与RNA-seq结果一致。结论:smc5基因敲除下调斑马鱼肝脏糖脂代谢。本研究结果为进一步研究SMC5基因在糖脂代谢调控中的潜在机制奠定基础。 相似文献
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肥胖基因和苗条蛋白——Leptin 总被引:4,自引:0,他引:4
最近肥胖基因被克卫,发现它在脂肪组织特异表达,编码的蛋白--Leptin可作用于下丘脑,产生抑制摄食、减轻肥胖、减少体重的效应,在体重稳态的维持中个有重要作用,它还对生殖系统、造血系统等有调节作用。肥胖基因的突变或者Leptin受体基因的突变可引起小鼠和大鼠发生肥胖,但尚未发现人的肥胖与肥胖基因突变有关。 相似文献
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目的:利用芯片数据分析工具对GEO基因芯片数据进行数据挖掘,系统分析肥胖与2型糖尿病患者肝组织相关基因表达的变化,探讨肥胖与2型糖尿病的联系及糖尿病早期预防和诊断的新靶点。方法:首先在公共芯片数据库中选择肥胖与2型糖尿病相关芯片数据(GSE15653),利用R等芯片数据分析工具分析肥胖与2型糖尿病患者肝组织基因的表达变化,并预测相关差异表达基因在血中蛋白表达。结果:肥胖患者与正常人肝组织比较发现412个差异表达基因,其中上调表达基因212个,下调表达基因200个,2型糖尿病患者中控制良好者与正常人肝组织比较发现486个差异表达基因,其中上调表达基因253个,下调表达基因233个,而2型糖尿病患者中控制不良者与正常人肝组织比较发现1051个差异表达基因,其中上调表达基因560个,下调表达基因491个;2型糖尿病控制良好者与肥胖患者肝组织有263个相同的表达变化基因,而2型糖尿病控制不良者与肥胖患者肝组织有131个相同的表达变化基因;结合蛋白质组学结果分析肥胖与2型糖尿病相关的差异表达基因中有30个蛋白表达产物是分泌型蛋白。结论:肥胖及2型糖尿病患者肝组织与正常肝组织比较基因表达均发生明显变化,其基因表达变化数目随疾病的严重性增加而增多,而且2型糖尿病的控制情况与肝组织基因表达变化有密切关系。肥胖与2型糖尿病相关的差异表达基因中表达分泌型蛋白的可进一步用于研发监测疾病发生发展的候选靶分子。 相似文献
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目的:筛查在正常人、单纯性肥胖患者及肥胖伴2型糖尿病患者内脏脂肪组织中差异表达的基因。方法:利用自制的高密度cDNA芯片,比较正常人、单纯性肥胖患者及肥胖伴2型糖尿病患者内脏脂肪组织中差异表达的基因,以寻找脂肪组织特异的与肥胖及糖尿病发生有关的基因。结果:和正常人相比,在肥胖患者及肥胖伴2型糖尿病患者中上调的基因分别有119个和257个,下调的基因分别有46和58个。这些基因中有77个在两组中均上调,其中包括与代谢有关的基因,如丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)以及窖蛋白、金属硫因蛋白等;8个基因在两组中均下调,其中包括脂肪合成途径中的关键酶,如3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(MGA)合成酶、脂肪酸合成酶及硬脂酰辅酶A脱氢酶。另外,酪氨酸-3单加氧酶-色氨酸-5单加氧酶活化蛋白θ(YWHAZ)仅在肥胖伴2型糖尿病患者中上调,而在单纯性肥胖患者中不变,该基因所编码的蛋白在胰岛素信号转导途径中起着负调控的作用。结论:脂肪组织中脂肪生成下降、脂肪酸氧化增加可能是肥胖及2型糖尿病中胰岛素抵抗发生的共同原因,其它基因功能的改变也可能参与了肥胖及2型糖尿病的发生,而胰岛素信号转导受阻可能是肥胖向糖尿病转化的促进因素。对这些基因的进一步研究将有助于更好地了解肥胖及糖尿病的发生机制。 相似文献
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人Leptin和肥胖的研究进展 总被引:3,自引:0,他引:3
肥胖已经成为一种社会现象,其发病过程复杂,危害严重。近年来的研究表明,肥胖是一种由食欲和能量调节紊乱引起的疾病,与遗传、环境、膳食结构等多种因素有关,其中基因是主要的决定因素。最近人和小鼠的肥胖基因被相继克隆,发现它能在脂肪组织特异表达,其编码的蛋白Leptin可作用于下丘脑,产生抑制摄食、减轻肥胖、减少体重的作用。此外,它还对生殖系统、造血系统等有调节作用。 相似文献
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肥胖相关蛋白及其基因表达 总被引:1,自引:0,他引:1
近年来,有关肥胖基因的研究颇为活跃,也取得了不少令人瞩目的成果,尤其在美、日等发达国家,这方面的研究已成热门研究领域,不断涌现出有关肥胖基因ob的克隆与表达[1、2],并相继克隆出它们的受体。在近5年内,有关研究肥胖基因的文章多达551篇。与肥胖密切... 相似文献
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《中国生物化学与分子生物学报》2007,(6)
有一项用小鼠的研究提示,不论出生前营养过剩还是营养不足,都会改变基因活性,导致小鼠成年期发生肥胖.研究者预言,该发现可能为肥胖的人提高更多的治疗方法.某些科学家已提出,肥胖与各种疾病的产生与胎儿发育所处的环境条件有关.为了测定胎儿基因活性的改变是否会启始肥胖,研究 相似文献
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为了研究鱼类的甲基转移酶set9 [SET domain containing (lysine methyltransferase) 9,也称作set7/setd7]在低氧耐受中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)基因编辑技术,在斑马鱼set9基因的第一个外显子上设计了Cas9的靶位点,对其进行基因敲除,获得了缺失8个碱基的set9基因敲除的斑马鱼品系。对受精后3d的斑马鱼幼鱼和3月龄的斑马鱼成鱼进行低氧胁迫处理,比较了野生型及set9基因敲除的斑马鱼的低氧耐受能力;并对低氧胁迫处理后的3月龄的野生型及set9基因敲除的斑马鱼成鱼的脑组织取材、固定并进行TUNEL染色。结果显示:set9基因敲除的斑马鱼与野生型相比,其低氧耐受能力显著增强,脑组织中的细胞凋亡水平显著减少。研究为进一步揭示鱼类甲基转移酶set9在低氧耐受中的功能和分子机制提供了线索,并为培育耐低氧鱼类新... 相似文献
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为了加快基因功能的研究,利用已有的来源于不同组织的cDNA克隆,并通过交换和购买补充了低丰度和染色体覆盖不完全的部分cDNA,研制开发出具有相当代表性、覆盖较完全的高密度cDNA表达型基因芯片,每张芯片上含有384个质控DNA和12 630个cDNA探针,其中包括12 508个Unigene和122个表达序列标签(EST).利用这些芯片,对肥胖患者及正常人内脏脂肪组织基因表达谱进行了初步研究,并发现在肥胖患者内脏脂肪组织差异表达的基因,其中上调的有与凋亡相关的基因、与免疫有关的基因以及与能量代谢有关的基因等,而下调的主要是与脂肪酸及胆固醇合成有关的基因,对这些基因进一步的功能研究将为阐明肥胖发生机制奠定基础. 相似文献
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为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。
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IFIT 家族由一类受干扰素诱导表达并具有TPR 结构域的蛋白组成, 但是在鱼类关于IFIT 基因的研究还很少。研究利用哺乳类IFIT 家族基因IFI56 的序列搜索斑马鱼基因组数据库鉴定出一个未知基因, 该基因具有哺乳类IFIT 家族保守的基因组结构, 编码蛋白具有保守的TPR 结构域, 暂命名为IFIT-A。RT-PCR 分析表明, Poly I:C 能够诱导IFIT-A 基因转录水平上调。与哺乳类IFIT 家族基因相似, 斑马鱼IFIT-A 启动子存在ISG 基因特有的典型ISRE 结构域。荧光素酶活性实验揭示Poly I:C 和重组IFN 蛋白能激活斑马鱼IFIT-A 启动子活性。此外, 过量表达IFN 调控因子IRF3 和IRF7 能诱导斑马鱼IFIT-A 启动子活性。实验结果证明IFIT-A基因是斑马鱼IFIT 家族成员, IRF3 和IRF7 在其诱导表中具有重要调控作用。
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Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链c DNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。 相似文献
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人类单基因肥胖的遗传学基础 总被引:2,自引:0,他引:2
肥胖是一种由遗传因素和环境因素共同作用导致的临床综合征,具有较高的遗传率。目前已经克隆了人类的7个基因,这些单基因突变可以独立地导致人类极度肥胖,其中6个都与食欲的中枢神经系统控制有关,1个与脂肪细胞分化调控有关。深入分析人类肥胖的遗传基础,对于阐明肥胖发生的机理以及对于抗肥胖药物的设计和筛选具有重要意义。 相似文献
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为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9 cDNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。本文选取两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(zCas9_bz和zCas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp及内源chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a)分别进行敲除,通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析比较了两种Cas9的敲除效率。结果发现,zCas9_wc在各种情况下都显现出较高的敲除效率,而zCas9_bz的效率相对较低。 相似文献