好氧发酵生产琥珀酸工程菌株的构建

通过分析大肠杆菌的碳源代谢途径, 利用基因敲除手段, 以Escherichia coli MG1655为出发菌株, 成功构建了琥珀酸好氧发酵生产工程菌E. coli QZ1111 (MG1655?ptsG?poxB?pta?iclR?sdhA)。检测结果表明该菌株能以葡萄糖为碳源, 在好氧发酵且不表达任何异源基因的条件下大量积累琥珀酸。摇瓶试验证明, 琥珀酸发酵产量达到26.4 g/L, 乙酸盐作为唯一检测到的副产物产量为2.3 g/L。二者浓度比达到11.5:1。     

产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建

基于产琥珀酸重组大肠杆菌E.coli B0013-1050的琥珀酸合成途径,利用Red同源重组技术结合Xer/dif重组系统敲除富马酸酶基因fumB、fumC,苹果酸酶基因maeB,构建L-苹果酸合成途径,最终得到重组大肠杆菌E.coli2030,该菌株在15 L发酵罐中,产L-苹果酸12.5 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%,同时对发酵产物中主要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。为进一步提高L-苹果酸的转化率,整合表达来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因,构建重组菌E.coli 2040,在15 L发酵罐中产L-苹果酸14 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率提高到60.3%。     

产D-乳酸重组大肠杆菌ptsG基因的敲除及其混合糖同步发酵

为构建能够同时高效利用五碳糖和六碳糖发酵产D-乳酸的重组大肠杆菌工程菌,以能高效利用五碳糖发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌E.coli JH13为出发菌株,通过Red同源重组技术敲除葡萄糖跨膜转运基因pts G。实验结果表明,pts G缺陷菌株E.coli JH15在10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)培养基中发酵,可同时利用五碳糖和六碳糖以完成发酵;而对照菌葡萄糖消耗完才利用木糖,发酵结束还有18 g/L木糖残留;JH15乳酸产量为83.04 g/L,相比于对照菌株提高了25.86%;在稻草秸秆水解液中发酵,JH15同时利用葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖,乳酸产量为25.15 g/L,转化率为86.42%。JH15作为能利用混合糖同步发酵产D-乳酸的大肠杆菌工程菌,它的成功构建为利用廉价的木质纤维素水解物为原料发酵生产D-乳酸提供参考依据。     

过表达羧化途径及失活苹果酸酶基因对大肠杆菌好氧发酵产苹果酸的影响

苹果酸是一种重要的C4二羧酸,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文主要研究羧化途径强化及苹果酸酶失活对大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的影响。首先在大肠杆菌E2中过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,得到菌株E21,苹果酸积累量从0.57 g/L提高到3.83 g/L。随后,分别过表达来自谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶基因pyc和来自琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck基因,相应的工程菌株E21(pTrcpyc)和E21(pTrc-A-pck)分别产6.04和5.01 g/L苹果酸,得率分别达到0.79和0.65 mol/mol葡萄糖。敲除E21中的苹果酸酶基因mae A和mae B,苹果酸产量也显著提高了36%,达到5.21 g/L,得率为0.62 mol/mol。然而,在过表达pyc的基础上敲除苹果酸酶基因并不能进一步提高苹果酸的产量。经过摇瓶发酵条件的初步优化,菌株E21(pTrcpyc)生产12.45 g/L苹果酸,得率为0.84 mol/mol,达到理论得率的63.2%。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

木糖发酵生产高纯度D-乳酸大肠杆菌工程菌LHY02的构建

高效利用木糖发酵生产D-乳酸或其他生物质产品,是充分利用木质纤维素的一个关键问题。以高效利用木糖产L-乳酸的Escherichia coli WL204为出发菌株,采用RED基因置换技术将ldhL基因置换为ldhA基因,获得一株能利用木糖产D-乳酸的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli LHY02,该菌株利用10%木糖发酵,D-乳酸产量达到84.4 g/L,产物光学纯度达到99.5%。此外,该菌株仍然具有较好的利用葡萄糖产D-乳酸的能力。     

敲除frdB基因对大肠杆菌厌氧混合酸发酵的影响

以SPUEC101(产琥珀酸)为出发菌,利用RED同源重组技术敲除延胡索酸还原酶基因frdB,得到重组菌株SPUEC103(△frdB),通过减少延胡索酸生成琥珀酸的通量,实现延胡索酸的积累。实验结果表明:敲除frdB基因后,缺陷菌株生长速率降低,利用葡萄糖的能力也有所降低,同时敲除frdB基因较大程度地改变琥珀酸、延胡索酸等的分布,在两阶段发酵中,当发酵培养基中添加30 g/L的葡萄糖时,琥珀酸和延胡索酸得率最高,对比SPUEC101,SPUEC103的琥珀酸产量产率由24.6%下降为15.4%,并有延胡索酸和少量的苹果酸生成,分别为0.182±0.002 g/L和0.023±0.002 g/L,同时丙酮酸和乙酸含量也略有升高,分别由1.87±0.02 g/L、0.012±0.002 g/L上升到2.36±0.03 g/L、0.862±0.012 g/L。     

代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

【背景】Escherichia coli AFP111发酵生产丁二酸时大量副产乙酸,丁二酸得率低。【目的】代谢工程改造EscherichiacoliAFP111,提高丁二酸得率,降低副产物乙酸的生成,建立100 L规模的丁二酸发酵工艺。【方法】一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因,改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达;单因素优化5L发酵罐培养条件。【结果】敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta、苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02菌株,摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42%,丁二酸得率提高9.85%。在SX02菌株基础上,经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk后获得菌株SX03,其Glk酶活性提高3.66倍,乙酸产量下降了31.62%,丁二酸得率提高8.28%。SX03菌株发酵生产丁二酸在5 L发酵罐进行放大,其乙酸产量为3.97 g/L,丁二酸得率为1.62 mol/mol葡萄糖,相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76%,丁二酸得率提高19.12%。在5L发酵罐上对比研究了中和剂Na2CO3和NaOH混合液替换碱式MgCO3的发酵效果,并优化了发酵pH、搅拌转速和葡萄糖浓度,获得如下最适发酵条件:pH6.8,搅拌转速250r/min,葡萄糖100g/L,发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L,丁二酸得率为1.66 mol/mol葡萄糖。中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65%,丁二酸得率提高2.47%。菌株SX03发酵工艺进一步在100 L发酵罐上实现放大,其乙酸产量为1.91 g/L,丁二酸得率为1.30 mol/mol葡萄糖。【结论】通过代谢工程改造的大肠杆菌,其副产物乙酸含量显著下降,丁二酸得率提高,并在5 L和100 L发酵罐上实现了工艺放大,展现出较大的工业化利用潜力。     

调控大肠杆菌胞内ATP和NADH水平促进琥珀酸生产

琥珀酸作为一种重要的C4平台化合物,广泛应用于食品、化学、医药等领域。利用大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产琥珀酸受胞内辅因子不平衡的影响,存在产率低、生产强度低、副产物多等问题。为此,对不同氧气条件下琥珀酸产量和化学计量学分析发现,微厌氧条件下E.coli FMME-N-26高效积累琥珀酸需要借助三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)为还原性三羧酸途径(reductive tricarboxylic acid pathway,r-TCA)提供足够的ATP和NADH。通过减少ATP消耗、强化ATP合成、阻断NADH竞争途径和构建NADH回补路径等代谢工程策略,组合调控胞内ATP与NADH含量,获得工程菌株E.coli FW-17。通过发酵条件优化,菌株E.coli FW-17在5 L发酵罐能积累139.52 g/L琥珀酸,比出发菌株提高了17.81%,乙酸浓度为1.40 g/L,降低了67.59%。进一步在1000 L发酵罐中进行放大实验,琥珀酸产量和乙酸浓度分别为140.2 g/L和1.38 g/L。     

大肠杆菌琥珀酸和乙酸合成途径的删除及其重组菌株的D-乳酸发酵

菌株CICIM B0013-030 (B0013,ack-pta,pps,pflB) 可积累D-乳酸作为主要发酵产物,然而副产物琥珀酸和乙酸的含量分别高达乳酸的11.9％和7.1％。为构建副产物含量低的产D-乳酸重组大肠杆菌菌株,本研究删除了菌株B0013-030的琥珀酸 (frdA) 和乙酸 (tdcDE) 合成途径,并考察了重组菌株在摇瓶和发酵罐中经两阶段发酵 (好氧生长菌体和厌氧发酵产酸) 利用葡萄糖发酵D-乳酸的性能。结果表明,分别构建含有frdA::difGm和tdcDE::difGm突变盒的重组质粒,并利用Red重组系统将突变盒整合于染色体上的目的基因,再利用Xer重组系统去除抗生素抗性基因,依次获得了重组菌株B0013-040B (B0013-030,frdA) 和B0013-050B (B0013-040B,tdcDE)。摇瓶发酵结果表明,frdA基因的删除使得菌株B0013-040B副产物琥珀酸的含量降低了80.8％;在7 L发酵罐中进行乳酸发酵,菌株B0013-040B的D-乳酸产量达114.5 g/L,光学纯度大于99.9％,但仍积累1.0 g/L琥珀酸和5.4 g/L乙酸。进一步删除了tdcD和tdcE基因的菌株B0013-050B,在7 L发酵罐中生产111.9 g/L D-乳酸,乙酸和琥珀酸的合成量分别降低为0.4 g/L,其他副产物含量也维持较低水平,表明该菌株具有较优良的D-乳酸发酵性能。     

常压室温等离子体诱变高效利用木糖产丁二酸菌株

大肠杆菌Escherichia coli AFP111是E. coli NZN111 (△pflAB△ldhA) 的ptsG自发突变株,其转化1 mol的木糖合成丁二酸的过程中净产生1.67 mol ATP,但是转化1 mol的木糖合成丁二酸的过程中实际需要2.67 mol ATP,因此在厌氧条件下,ATP的供给不足导致E. coli AFP111不能代谢木糖。采用常压室温等离子体射流诱变产丁二酸大肠杆菌菌株,在厌氧条件下,利用以木糖为碳源的M9培养基,筛选得到一株可以代谢木糖并积累丁二酸的突变株DC111。该突变菌株在发酵培养基中,72 h内可以消耗10.52 g/L木糖产6.46 g/L的丁二酸,丁二酸的得率达到了0.78 mol/mol。而且突变株中伴有ATP产生的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PCK) 途径得到加强,PCK的比酶活相对于出发菌株提高了19.33倍,使得其在厌氧条件下能够有足够的ATP供给来代谢木糖发酵产丁二酸。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

大肠杆菌工程菌ptsG基因敲除及其缺陷株混合糖同型乙醇发酵

为实现可同时利用木糖和葡萄糖进行生产发酵,以产乙醇的大肠杆菌工程菌SZ470为出发菌株(△pflB,△frdABCD,△ackA,△ldhA),采用同源重组技术,敲除葡萄糖转运基因ptsG,以构建不受葡萄糖抑制效应影响的菌株SZ470P.SZ470P在5％混合糖(2.5％木糖和2.5％葡萄糖)培养基中能同时利用葡萄糖和木糖进行发酵,葡萄糖消耗量是13 g/L,为对照菌株SZ470的一半;木糖消耗量是20 g/L,是SZ470的3.8倍;乙醇的最高产量为15.01 g/L,转化率为89.13％,比SZ470提高了14.32％.结果表明,工程菌SZ470P可同时利用葡萄糖和木糖发酵生产高产量的乙醇.     

进化代谢选育高渗透压耐受型产琥珀酸大肠杆菌

在以碳酸钠为酸中和剂的大肠杆菌两阶段发酵产琥珀酸的过程中,由于Na+的积累造成发酵体系中渗透压的提高,严重抑制了琥珀酸的产物浓度。为了增强大肠杆菌对渗透压的耐受性,考察了利用进化代谢方法筛选高渗透压耐受型高产琥珀酸大肠杆菌菌株的可行性。进化代谢系统作为一种菌株突变装置,可以使菌体在连续培养条件下以最大的生长速率生长。以NaCl为渗透压调节剂,通过在连续培养装置中逐步提高NaCl浓度使菌体在高渗透压条件下快速生长,最终得到了一株高渗透压耐受型琥珀酸生产菌株Escherichia coli XB4。以碳酸钠为酸中和剂,在7 L发酵罐中利用Escherichia coli XB4进行两阶段发酵,厌氧培养60 h后,琥珀酸产量达到了69.5 g/L,琥珀酸生产速率达到了1.81 g/(L.h),分别比出发菌株提高了18.6%和20%。     

大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的代谢工程研究

目的:对大肠杆菌进行代谢网络改造,考察木糖好氧发酵生产琥珀酸的可行性。方法:以有氧条件下大肠杆菌木糖生物合成琥珀酸的代谢途径分析为基础,以大肠杆菌BL21为出发菌株,通过P1噬菌体一步敲除法敲除琥珀酸脱氢酶基因(sdhA)、磷酸转乙酰基酶基因(pta)、丙酮酸脱氢酶基因(poxB)及异柠檬酸裂解酶阻遏物基因(iclR),构建木糖好氧发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌JLS400(△poxB△pta△iclR△sdhA)。将携带磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的质粒pJW225转化到JLS400中。结果:摇瓶发酵结果表明,构建的工程菌能以木糖为碳源,在好氧发酵条件下琥珀酸产率较高,副产物仅有少量乙酸和丙酮酸。结论:基因工程大肠杆菌JLS400pJW225的构建,为有氧条件下以木糖为原料生产琥珀酸的进一步研究奠定了基础。     

副产物途径的缺失对大肠杆菌合成D-1,2,4-丁三醇的影响

【目的】敲除副产物途径,提高重组大肠杆菌D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-Butanetriol,BT)产量。【方法】利用Red重组技术敲除木糖途径xyl AB基因及2-酮-3-脱氧木糖酸代谢途径的yag E及yjh H基因,考察其对重组菌生长、BT生产及副产物积累的影响。【结果】敲除xyl AB基因后,重组菌生物量降低57%,BT产量降低20%,单位菌体产量提高84%,木糖酸积累量提高52%。yag E或yjh H基因单独缺失重组菌生物量分别提高10%和5%,BT产量提高36%和14%。基因共同缺失后重组菌生物量降低了21%,BT产量提高184%,达到2.44 g/L,单位菌体产量提高258%。而共同敲除两途径,生物量降低了72%,虽然单位菌体产量提高了约4倍,但BT产量仅提高43%。p H调控下,重组菌木糖酸积累量下降,BT产量进一步提高,最高达3.11 g/L。【结论】xyl AB基因缺失后,虽有利于提高BT途径的效率,但由于木糖无法进入PPP途径及木糖酸积累,造成生物量降低,不利于BT合成。单独敲除yag E或yjh H后BT产量略有提高,而共同敲除这两基因更为有效地调整碳流向BT合成偏转。两途径共同敲除利于BT的合成,但由于菌体量的减少,无法大量获得BT。     

利用代谢工程改善大肠杆菌的3-脱氢莽草酸生产

3-脱氢莽草酸是芳香族氨基酸合成代谢途径中的一种重要中间产物。除可作为一种高效的抗氧化剂,还可用于合成己二酸、香草醛等一些重要的化工产品,具有重要的应用价值。相关研究证明具有去酪氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroFFBR以及转酮醇酶基因tktA可以有效影响3-脱氢莽草酸的过量合成。通过增加aroFFBR和tktA串联过量表达的拷贝数,可使工程菌株在摇瓶发酵条件下3-脱氢莽草酸产量提高2.93倍。通过同源重组无痕基因敲除技术依次敲除出发菌大肠杆菌Escherichia coli AB2834的乳酸、乙酸、乙醇等副产物合成途径中的重要基因ldhA、ackA-pta和adhE,可使工程菌株的3-脱氢莽草酸产量进一步提高,达到了1.83 g/L,是初始出发菌株大肠杆菌E.coli AB2834产量的6.7倍。利用5 L发酵罐进行分批补料发酵,62 h后工程菌株3-脱氢莽草酸产量达到了25.48 g/L。本研究可为构建有应用前景的3-脱氢莽草酸生产菌株提供重要参考。     

代谢木糖重组谷氨酸棒杆菌的构建

为了使谷氨酸棒杆菌较好地利用木糖生产有机酸,将来自Escherichia coli K-12的木糖异构酶基因xylA构建到表达载体pXMJ19中,导入Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δldh中,成功表达了该酶基因。结果表明:重组菌株在以木糖为唯一C源进行发酵时,木糖的消耗速率为0.54 g/(L·h),木糖异构酶比酶活约为0.54 U/mL;在以木糖和葡萄糖的混合糖为C源进行发酵时,菌株优先利用葡萄糖,在葡萄糖完全消耗后,菌株开始有效利用木糖;以木糖为唯一C源进行两阶段发酵时,琥珀酸的收率可达(0.62±0.003)g/g。     

细胞分裂蛋白编码基因的敲除对丙酮丁醇梭菌溶剂合成与细胞形态的影响

丙酮丁醇梭菌是生物丁醇合成的重要菌株,近年来,研究者们利用基因编辑等技术对其进行菌株改造。通过对丙酮丁醇梭菌中3个细胞分裂蛋白(RodA、DivIVA、DivIB)编码基因(cac1251、cac2118、cac2125)进行敲除,发现cac2118敲除菌株的细胞在产溶剂期为球状形态,细胞变小,ABE发酵的丁醇得率为0.19 g/g,与野生型相比提高了5.6%。cac1251敲除菌株的葡萄糖消耗量和丁醇产量与野生型相比降低了33.9%和56.3%,分别为47.3 g/L和5.6 g/L。cac1251和cac2125的敲除对细胞生长有显著影响,菌体浓度最大值与野生型相比分别降低了40.4%和38.3%。研究表明细胞分裂蛋白DivIVA对细胞的形态和大小调控起重要作用;细胞分裂蛋白RodA和DivIB调控细胞分裂进程,进而影响细胞生长和溶剂合成进程。     

大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响

为明晰葡萄糖非PTS转运系统相关基因对木糖利用效率的影响,探讨葡萄糖PTS和非PTS转运系统是否对木糖利用存在协同影响,以大肠杆菌工程菌SZ470和SZ470P为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB,构建mglB单缺陷菌SZ470M和ptsG/mglB双缺陷菌SZ470PM。比较四株菌的混合糖(3%葡萄糖+2%木糖)发酵情况以及木糖转运代谢相关基因的转录水平。实验结果表明,SZ470M相较于出发菌株SZ470,其发酵性能无明显变化;SZ470PM的木糖消耗速度为0.37 g/L,乙醇产量为23.25 g/L,转化率为82.6%,相比于出发菌株SZ470P分别提高了32%,9.8%和5.8%。基因转录水平的分析也表明菌株SZ470P和SZ470PM的木糖转运与代谢基因的转录水平上调。综上,ptsG和mglB基因的双敲除对木糖利用效率的提高有协同影响,为促进木质纤维素作为发酵原料时木糖的高效利用提供理论依据。