尿样在SELDI技术中的优化研究

目的:建立表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF/MS)技术检测尿液样本的方法。方法:采用SELDI技术及弱阳离子交换表面蛋白芯片(CM10)对糖尿病病例组和正常对照组的尿液样本进行分析,从尿液标本的采集、样品保存、上样浓度的控制、实验仪器的内外校准、实验结果重复性验证与分析等方面进行实验条件的优化。结果:反复冻融3次以上的样品经SELDI检测的出峰数量和峰强度情况较差;以1:1或1:2的浓度作倍比稀释后的样本经芯片检测得到的蛋白峰强度和蛋白数量最优;对两组样本重复检测3次,蛋白丰度的平均变异系数(CV值)分别为0.121和0.095;两组样本共检测到202个蛋白峰,其中差异表达蛋白29个,在肝纤维化组中表达上调13个,表达下调16个。结论:初步建立了SELDI技术检测尿液样本的方法,提高了SELDI技术检测尿液样本的质量。     

多重检验法在基因芯片研究中鉴定差异表达基因的统计功效

鉴于基因芯片实验的造价,在基因芯片实验设计中,首要考虑的因素是需要多少重复才能检测出一个具有显著差异表达的基因。计算多重检验法要求的重复数（样本大小）或功效可为基因芯片实验设计提供重要的参考。为此,本文基于置换重抽样法构建了一种基因表达噪声混合分布模型。该方法适用各类基因表达数据,即无论是基因表达单噪声源或是多噪声源都可行。应用混合模型和多重检验法并给定统计功效。研究者能在基因芯片实验中获得所需要的最少生物学重复数：或者根据样本大小来确定测定一个显著差异表达的基因所具有的检验功效;或者根据样本大小和统计检验功效,选择最好的统计测验方法。本文以一组在老鼠中与中风有关的3000个基因的基因芯片实验所获得的数据为例,应用该方法拟和后组建了一个单分布模型（即表达单噪声源的分布模型）。根据该模型,我们计算了4种多重检验法在鉴定一个具有表达差异（D）值的基因中所需要的统计功效。结果表明。检测一个小的差异D值,4种多重检验法中B方法的统计功效最低,而BH方法最高。但是,对于鉴定一个具有最大表达差异的基因时,4种方法有相同的鉴定功效。与传统的单个检验法一样,BH方法检测一个小的变化所需要的效率不会随基因数目增加而改变,其他3种多重检验法的检测功效则随基因数目增加而降低。     

利用混合样本池法对鸡显性白羽基因PMEL17突变位点的检测

显性白羽基因座是影响鸡羽色形成的重要基因座位之一, 该基因座上的显性等位基因I 会抑制黑色素合成, 从而使携带该基因的个体全身羽毛呈现白色。目前已确认鸡显性白羽基因座编码PMEL17蛋白: 是一种黑素细胞特异性蛋白, 在黑素细胞的分化与成熟中起到重要作用, 并证明PMEL17基因的突变与显性白羽的形成有关。文章利用混合样本池建立了一种低成本、高效率, 并能在大规模群体中检测PMEL17基因突变的方法, 称为PCR产物混合样本池法。该方法的基本步骤如下: 首先, 提取个体基因组DNA, 并设计相关引物对每一个体单独进行PCR扩增; 其次, 将PCR产物等比例混合, 10个样品混在一个池中; 然后, 将PCR产物混合池样品于非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳; 最后, 待电泳结束后进行银染, 根据凝胶上所显条带判定是否存在突变体。此外, 文章还将这种方法与传统基因组DNA混合样本池法进行了比较试验, 并利用该方法对试验鸡群显性白羽基因PMEL17突变进行检测, 证实该方法具有较高准确度。     

多重定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的构建

摘要 目的：建立一种快速、灵敏的方法检测人源异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)中小鼠细胞的浸润比例,以确保PDX模型的保真性。方法：选择人和小鼠的特异性基因PSMB2、Ren 2的部分区段设计引物和探针,利用多重荧光定量PCR（TaqMan探针法）在单管中检测PDX模型中小鼠-人细胞的相对量。另外,构建了不同浸润比例的标准品作为阳性对照,根据标准曲线进行样本比例计算。结果：建立了一种多重荧光定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的检测方案,该方案显示,PDX模型中不同比例的人鼠混合样本与△Ct值（Ct（小鼠）-Ct（人））之间线性关系良好,相关系数r²为0.9998。利用该方法对14个样本进行检测,结果表明在绝大部分样本中小鼠细胞的比例低于30.00%,平均小鼠细胞比例为13.38%。结论：本研究建立的多重定量PCR检测PDX模型中小鼠细胞浸润比例的方法能够根据△Ct值快速、准确推断PDX模型中人、小鼠细胞的比例。该方法操作简单、耗时短、结果可靠,是一种快速、灵敏的PDX模型的质控方案。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

应用LNA-PCR法检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药位点基因突变

目的:建立简便、快速、灵敏的锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法,检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药相关位点(rtA181V、rtN236T)突变。方法:通过基因测序筛选阳性样本,进而构建ADV rt181和rt236位点野生株和突变株重组质粒,设计包含扩增阿德福韦酯rtA181V和rtN236T耐药位点在内的特异性引物和LNA荧光探针,以构建的重组质粒为标准品建立实时荧光PCR反应体系,并通过与基因测序平行检测血清样本以判断检测方法的可行性与准确性。结果:所建立的LNA-PCR法能够检测102copies/ml的HBV中ADV基因突变,同时具备较高的特异性。通过对89例ADV治疗一年后HBV阳性临床样本进行检测,有8例(8.98%)rtA181V突变、5例(5.61%)rtN236T突变、2例(2.24%)rtA181V和rtN236T混合突变,检测结果与测序结果一致。结论:所建立的LNA-PCR法是一种简便、快速、灵敏的基因突变检测方法,能有效的区分单碱基突变,对慢性乙型肝炎患者德福韦治疗过程中耐药突变的监控和抗病毒药物的调整具有指导意义。     

核酸定量检测试验应用于HIV-1感染实验室诊断的探讨

目的:探讨核酸定量检测在HIV-1感染实验室诊断中的应用。方法:选取145例第四代抗原/抗体联合诊断筛查试验为阳性反应的血浆样本,分别用Western印迹和HIV-1核酸定量方法进行检测,综合对比分析2种方法检测结果。结果:Western印迹检出阳性样本120例,不确定样本17例,阴性样本8例;HIV-1核酸定量试验检出结果大于检测限样本131例,其中包括12例Western印迹不确定样本、2例Western印迹阴性样本;有3例Western印迹阳性样本用HIV-1核酸定量检测试验未能检出。结论:核酸定量检测试验对于HIV-1感染阳性样本是一种有效的实验室诊断方法;对HIV-1核酸定量检测结果为"TND"的样本,建议加做Western印迹或结合其他补充试验结果进行综合诊断。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

棉花黄萎病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

利用棉花黄萎病菌ITS区特异性引物建立了棉花黄萎病菌的实时荧光定量PCR检测方法。利用实时荧光PCR体系,以324 bp的PCR扩增产物构建了标准曲线并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果表明:该方法特异性良好,检测灵敏度为100 copies·μL-1,标准曲线的相关系数为0.994,扩增效率为91.5%。利用建立的检测方法对转基因棉田及常规棉田土壤样本进行检测,结果表明转基因棉田中棉花黄萎病菌数量显著高于常规棉田,与实际观测到的现象一致,也证明了本方法的可行性。因此,本研究建立的棉花黄萎病菌检测方法具有灵敏度高、重复性好等特点,为棉花的种植及病害防治提供了有效的检测手段。     

尿样在SELDI技术中的优化研究

目的：建立表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI．TOF／MS）技术检测尿液样本的方法。方法：采用SELDI技术及弱阳离子交换表面蛋白芯片（CM10）对糖尿病病例组和正常对照组的尿液样本进行分析,从尿液标本的采集、样品保存、上样浓度的控制、实验仪器的内外校准、实验结果重复性验证与分析等方面进行实验条件的优化。结果：反复冻融3次以上的样品经SELDI检测的出峰数量和峰强度情况较差;以1：1或1：2的浓度作倍比稀释后的样本经芯片检测得到的蛋白峰强度和蛋白数量最优;对两组样本重复检测3次,蛋白丰度的平均变异系数（CV值）分别为0．121和0．095;两组样本共检测到202个蛋白峰,其中差异表达蛋白29个,在肝纤维化组中表达上调13个,表达下调16个。结论：初步建立了SELDI技术检测尿液样本的方法,提高了SELDI技术检测尿液样本的质量。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测 HBV DNA

目的:本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法.方法:利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5'端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素.核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体.将扩增产物与展开液混合后点样,10min 后即可用肉眼判读结果.在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价.最后收集15例阴性样本及33例HBsAg 阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较.结果:试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250eopies/mL.在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%.且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异.结论:核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用.     

IMSA技术快速检测沙门氏菌方法的建立及应用

[目的]建立和评价一种快速、准确地检测食品中沙门氏菌的检测方法,对食品安全控制具有重要意义。[方法]应用等温多自配引发扩增技术(Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA),设计筛选出沙门氏菌的特异性基因inv A基因的IMSA引物,并建立检测沙门氏菌的IMSA法。对建立的方法进行特异性和灵敏度试验;确定人工污染样本能被该方法检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;利用IMSA法和培养法对13份食品样本进行检测,评价两者的一致性。[结果]该方法仅对沙门氏菌特异性扩增,灵敏度达3.02×10~2CFU/m L;人工污染样本最短培养6 h可被IMSA法检出,检出限为3.17CFU/25 g; 13份食品样本的IMSA法与培养法结果一致性为100%。[结论]IMSA技术检测沙门氏菌的灵敏度高、特异性强、结果准确,可在7h内完成食品中沙门氏菌的检测,适合用于食品中沙门氏菌的快速检测。     

呼吸道感染住院患儿Merkel细胞多瘤病毒检测及临床研究

目的:了解北京地区Merkel细胞多瘤病毒(MCPyV)在呼吸道感染住院儿童中的流行情况和临床特点。方法:采集北京友谊医院儿科呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本200份,并收集相应的患儿临床资料,采用TaqMan real-time PCR方法检测MCPyV LTAg基因,并经测序确认;MCPyV阳性样本同时检测常见的人呼吸道病毒混合感染情况。结果:200份标本中共检出MCPyV阳性6例,检出率3%;感染儿童年龄从6月到5岁,其中年龄≤3岁的占83.3%(5/6)。诊断包括支气管肺炎和急性支气管炎,临床表现包括发热、咳嗽、喘息。6例阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染,A型流感病毒和呼吸道合胞病毒混合感染最常见,6例阳性样本MCPyV载量均低于10拷贝/μL。结论:real-time PCR方法检测呼吸道感染住院患儿中MCPyV的感染率为3%,6例MCPyV阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染且MCPyV载量较低,不能认为MCPyV是儿童呼吸道感染的病因。     

磁纳米散射探针暗场超灵敏检测具核梭杆菌

【背景】具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）作为机会致病菌,能够引起许多感染性疾病,已被证实是促直肠癌发展的潜在重要危险因素,临床检测中亟需一种快速简单检测F. nucleatum的方法。【目的】通过建立一种磁纳米探针结合暗场显微镜直接观察计数的方法,可方便快速地检测样本中具核梭杆菌的数量。【方法】在磁纳米颗粒（magnetic nanoparticle,MNP）表面修饰制备的抗F. nucleatum抗体,构建一种特异性结合F. nucleatum的MNP探针。此外,比较MNP探针-暗场显微计数法与实时荧光定量PCR （qPCR）方法检测F. nucleatum的灵敏度。【结果】该方法的检测限可低至3.42×10¹ copies/μL,比qPCR的灵敏度高5倍左右。在实际样本的检测中,该方法与qPCR方法所检测F.nucleatum数量保持一致。【结论】本研究建立的方法用于检测F.nucleatum,操作简单、检测快速（约30 min）、灵敏且成本低,有应用于临床样本检测的前景。     

基于最大熵原理的浙江毛竹胸径分布及测量不确定度评定

应用最大熵原理构造了测树因子概率分布的统一模型,这样构造的模型具有明确的解析表达式,并能克服常用方法无法解释测树因子服从某种概率分布的真正原因,从而为测树因子统计分布建模提供了一种有效方法.使用1-3阶样本矩、1-4阶样本矩与1-5阶样本矩,用所构建的概率分布统一模型分别对浙江省域毛竹胸径分布分别作了仿真试验,结果表明当采用1-4阶样本矩时,仿真效果最好,而且比通过假设检验的Weibull分布仿真结果理想:(1)图形非常相似,对实测数据都能很好的模拟;(2)最大熵法的离差平方和为0.00018,Weibull分布的为0.00045[1].由于各种系统与非系统的原因,都会影响测量结果的准确性,对所构建的模型作了不确定度评定,表明结果具有很大的可靠性,测量结果的估计:7.85100,测量结果的标准不确定度:1.82710,置信概率:0.96020.     

牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立

本研究旨在建立一种牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法,并评价该方法用于牛结核病检测的价值。通过筛选与天然牛γ干扰素特异性结合的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体,并探索不同的实验条件确定最佳包被抗体浓度、最佳细胞数量和最佳检测抗体浓度等,建立牛γ干扰素ELISPOT检测方法。采集30头奶牛尾静脉血并分离外周血单个核细胞,以结核菌素作为刺激原,使用建立的ELISPOT检测方法进行牛结核病检测,并与BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果进行比较。筛选到两株与天然牛γ干扰素特异性结合的单抗2G5和5E11,确定ELISPOT检测方法的最佳实验条件为:包被抗体2G5浓度2.5μg/m L,每孔细胞数量2.5×105个,检测抗体Bio-5E11浓度1μg/mL。使用建立的ELISPOT检测方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒对30头奶牛进行同步检测,结果显示,以BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准,14头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阳性牛中,ELISPOT方法检出的阳性牛为11头,敏感性为78.6%(11/14);16头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阴性牛中,ELISPOT方法检出的阴性牛为12头,特异性为75%(12/16)。应用结核菌素作为刺激原的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法可用于牛结核病辅助检测,具有潜在的临床应用价值。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本.方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度.结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同.结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景.     

重要肠道病原菌多重PCR-基因芯片检测方法研究

目的:建立并初步评价一种针对重要肠道病原菌的多重PCR 基因芯片检测方法。方法：对筛选出的特异引物进行多重PCR优化,将引物分别按种属内混合和种属间混合的方案排查引物间的竞争性抑制现象,再将不同菌属的模板混合,用相对应的混合引物扩增,探寻高效特异的引物组合。分别掺入和不掺入荧光素,验证其对混合PCR反应的影响,并与芯片杂交,探寻多重PCR扩增效率对芯片杂交的影响。分析不同数量引物组合产生的杂交结果,筛选出无交叉反应的最优引物组合。结果:种属内引物混合均得到特异性扩增结果。种属间混合霍乱弧菌和空肠弯曲菌得到部分预期条带,随着混合引物数量的增加,交叉抑制现象也增多。杂交信号强度随多重PCR扩增效率的增加而增强。反应中掺入荧光素的扩增条带产量低于无荧光素的产物。可将35对混合引物拆成3个体系分别标记样品,以避免假阴性结果。结论:PCR反应中掺入荧光素降低扩增效率和杂交效率,但并不影响对杂交结果的判读和数据分析。基因芯片杂交信号强度取决于多重PCR的扩增效率。肠道病原菌多重PCR 基因芯片检测方法具有较高的特异性,混合PCR可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛检。该基因芯片检测可以采用3个引物体系完成样品标记。