人C反应蛋白在不同原核表达载体及菌株中的表达及免疫反应性分析

构建人C反应蛋白(CRP)原核表达载体,并分别将其转化进入E.coli BL21(DE3)和Rosetta gami 2(DE3)p Lys S中,诱导CRP重组蛋白的表达;主要运用了基因工程,亲和层析及透析复性等方法。成功构建了CRP原核表达载体及菌株。经IPTG诱导后,得到了不同的重组CRP蛋白。结果表明,相同表达载体在不同的表达菌株中的表达情况有一定差别,分别在大肠杆菌及Rosetta gami2(DE3)p Lys S中表达并得到了重组CRP的包涵体,对复性后的CRP重组蛋白进行Westen blotting及ELISA检测,结果表明原核表达的重组CRP蛋白的免疫反应性很低,CRP蛋白发挥免疫活性需要以五聚体形式存在。     

甲胎蛋白的原核表达及复性优化

构建甲胎蛋白的原核表达载体p ET32a-AFP,对包涵体形式表达的甲胎蛋白进行复性优化。将构建的重组质粒p ET32a-AFP转化入E.coli,IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化获得AFP包涵体,通过对复性过程、p H、添加剂等的研究摸索,获得最佳复性条件。当采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析复性方法,且透析液p H值为8.5,重组人AFP包涵体蛋白起始浓度为1.0 mg/m L时,复性效率最高。该复性方法获得蛋白质具有较高的回收率且操作简便。     

东亚三角涡虫PSA蛋白的表达、鉴定及抑菌分析

PCR扩增含酶切位点的DjPsa基因(ORF),构建了DjPsa基因的原核表达载体pET-28a(+)-DjPsa,转化入Ecoli BL21(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting(His-Tag抗体)分析表达蛋白,抑菌试验检测其活性.结果表明,重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,其蛋白的分子大小约为25 kD;Western blotting检测说明得到的蛋白为PSA重组蛋白:抑菌试验显示复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础.     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白在原核系统中的表达

[目的]构建点突变的GLP-1Gly8,并与人血清白蛋白(HSA)结构域Ⅰ融合,延长GLP-1的半衰期。[方法]采用常规PCR扩增白蛋白结构域Ⅰ片段,利用SOE-PCR扩GLP-1Gly8基因并将两个基因拼接,得到的HSA-GLP-1Gly8融合基因经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到p ET30a表达载体,重组质粒p ET30a-HSA-GLP-1Gly8转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中进行IPTG诱导表达。[结果]PCR扩增分别获得140 bp的GLP-1Gly8基因499 bp的HSA的片段及经融合后的HSA-GLP-1Gly8基因。表达载体p ET30a-HSA-GLP-1Gly8在E.coli BL21(DE3)宿主菌中经IPTG诱导,过表达了分子量约为22 k Da的融合蛋白。[结论]成功构建了p ET30a-HSA-GLP-1Gly8原核表达载体,融合蛋白在BL21(DE3)菌中以包涵体的形式过表达。     

痢疾志贺菌侵袭素IpaC的原核表达及纯化复性

目的为进一步研究痢疾志贺菌侵袭素IpaC蛋白的侵袭活性,必须先获得IpaC重组融合蛋白。方法将IpaC基因亚克隆至表达载体pET-24α(+)中,转化至E.coli BL21(DE3)表达宿主菌中,采用IPTG优化诱导表达,然后纯化复性重组蛋白。结果重组蛋白最佳表达条件为0.50mmol/L IPTG、30℃诱导6h,获得分子量约为33kDa的IpaC重组蛋白。Western blotting证实了重组蛋白的特异性。IpaC重组蛋白主要以包涵体形式在宿主菌中表达,通过纯化后得到单一的目的蛋白。结论成功构建IpaC原核表达体系,并获得了蛋白的高效表达及优化。初步建立了IpaC重组蛋白的纯化方案。为进一步研究IpaC的侵袭性作用奠定了基础。     

大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定

旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建s FcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠s FcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠s FcγRIIb基因,构建原核表达载体s FcγRIIb-p ET17b,转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白s FcγRIIb可被特异性抗体所识别且与Ig G具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。     

内生真菌Shiraiasp.Slf 14中菊粉酶基因的克隆、表达及包涵体复性

为了实现内生真菌Shiraia sp.Slf 14菊粉酶基因在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的包涵体复性技术,获得有活性的重组菊粉酶,本研究通过提取Shiraia sp.Slf 14的总RNA,反转录合成cDNA,设计PCR引物扩增出菊粉酶基因,将其克隆至pET-22b(+)载体后转入E.coli BL21(DE3),利用SDS-PAGE法检测IPTG诱导表达后重组蛋白的表达情况,并进一步检测了包涵体复性及重组酶酶活情况,最终成功获得了相对分子量为62.07 kD的重组蛋白,成功复性包涵体,复性率为25.23%,重组菊粉酶活力为6.84 U/m L。本研究为活性重组菊粉酶的获得及包涵体复性提供了新的方法和依据。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

猪细小病毒1型VP2基因的原核表达及反应原性分析

旨在研究猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白(第155-439位氨基酸)的抗原性,为开发PPV1的检测方法奠定基础。以PPV1型AV31株的DNA为模板,扩增获得849 bp的目的片段,扩增产物克隆入p ET30a(+)原核表达载体,构建p ET30aPPV1-VP2(155-439 aa)重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3);在37℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDS-PAGE分析表明,该VP2编码基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为39 k D;Western blot检测结果表明,该重组蛋白与PPV1阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PCV2阳性血清不发生交叉反应。该实验成功构建了PPV1-VP2(155-439 aa)原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性。     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其

为了研究重组人纤溶酶原 Kringle1-5(K1-5)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响, 通过PCR扩增人纤溶酶原K1-5 cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-K1-5, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE 和Western 杂交检测K1-5的表达。鸡胚尿囊膜 (CAM) 实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle1-5对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-K1-5在E.coli BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%, K1-5主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Ni-spin 亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K1-5蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K1-5能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K1-5特异地抑制内皮细胞的增殖, 而对非内皮细胞无抑制作用。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的透析复性方法,获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板,PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因,克隆至p ET-22b(+),转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况,采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白,相对分子量约为54.8k Da,成功复性包涵体,复性效率为22.78%,重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,包涵体经透析法成功复性,获得具有催化活性的重组淀粉酶。     

菠菜SoHb基因的原核表达及功能分析

为了进一步揭示菠菜非共生血红蛋白(SoHb)的功能,通过RT-PCR的方法从菠菜根中克隆了SoHb基因编码区全长序列,并将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体p ET32a-SoHb,并转化大肠杆菌BL21 star(DE3)获得原核表达工程菌株。通过IPTG法诱导该重组质粒在大肠杆菌中得到高效表达,融合蛋白分子质量约为38 kDa,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经Ni2+NTA亲和柱纯化,获得纯化的融合蛋白。与空载体相比,重组菌对硝化胁迫的抗性增加。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,并对其进行了Western blot检测。实验结果为进一步研究菠菜SoHb基因功能奠定了基础。     

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2的表达纯化及活性鉴定

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2 (TIMP-2) 抑制肿瘤迁移及侵袭。文中以人TIMP-2为研究对象,探索人TIMP-2蛋白的原核表达特征,并进行纯化及活性鉴定。以人肺癌A549细胞的总RNA反转录得到的cDNA为模板,克隆人TIMP-2基因,构建pET28a重组表达载体;经酶切检测和测序分析的重组表达载体pET28a-TIMP-2转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达,并对表达条件进行优化。经镍亲和柱纯化后,用Western blotting法鉴定融合蛋白His-TIMP-2,并用明胶酶谱法检测融合蛋白的活性。研究发现融合蛋白His-TIMP-2在E. coli BL21(DE3) 中以包涵体的形式存在;在一定范围内,IPTG浓度对His-TIMP-2的表达量没有显著影响;而在该表达系统中,诱导温度和时间是关键参数,His-TIMP-2的表达量随诱导温度升高而增加;纯化并复性后的融合蛋白His-TIMP-2能有效抑制人肺癌A549细胞表达的基质金属蛋白酶的活性。具有活性的融合蛋白的获得为后续深入研究人TIMP-2的功能及机制奠定基础,并对肿瘤治疗具有重要意义。     

VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究

[目的]构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。     

小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究

构建小鼠β-防御素-2( mouse beta defensins 2,mBD2)原核表达质粒pET32/mBD2,进行蛋白诱导表达及纯化,测定并纯化蛋白的抗菌活性.旨在为选一步研究其生物学特性奠定基础.通过腹腔注射脂多糖(lipopoly-saccharide,LPS)建立小鼠急性时相反应,采用RT-PCR方法扩增mBD2成熟肽,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pET-32a(+)载体,构建的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白.将融合蛋白采用肠激酶酶切、洗脱并用滤纸片法测定目的蛋白的抗菌活性.成功构建了原核表达质粒pET32a(+)/mBD2,并转化工程菌BL21( DE3).在0.25 mmol/L IPTG、30℃诱导4h条件下获得的融合蛋白.采用抑菌试验证实蛋白具有一定的抑制革兰阳性菌及阴性菌生长的作用.本研究成功构建了pET32/mBD2原核表达质粒,得到了在大肠杆菌中稳定表达mBD2蛋白.     

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因（UK114）的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。