家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

家蝇Denfensin-1基因的克隆、诱导表达及启动子活性分析

【目的】鉴定一种新的家蝇Musca domestica防御素基因, 并分析其功能。【方法】从家蝇转录组数据库中鉴定了1条新的防御素基因cDNA序列, 并将其命名为家蝇防御素1 (Md-defensin-1)基因Mdde-1。利用生物信息学网站、 软件预测其结构等信息。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的表达模式, 并且利用基因步移技术获得了启动子序列, 同时采取细胞转染技术验证Mdde-1启动子活性。【结果】该序列包含一个276 bp的开放阅读框, 编码91个氨基酸残基。推导的氨基酸序列N端包括1个23个氨基酸残基的信号肽和1个28个氨基酸残基的前肽。成熟肽由40个氨基酸残基组成, 含有1个典型的CSαβ基序。实时荧光定量PCR结果显示, 家蝇2龄幼虫受金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (G+)刺激后Mdde-1表达明显上调, 而大肠杆菌Escherichia coli (G^-)刺激后表达下调;Mdde-1在家蝇幼虫受到热激时呈上调表达。为进一步研究其调控机制, 克隆了Mdde-1启动子, 并证明了该启动子具有活性。【结论】据此认为Mdde-1是一种新的家蝇防御素, 并且在免疫革兰氏阳性菌方面发挥重要作用; 同时我们首先证明了Mdde-1的启动子具有活性。本研究为进一步研究家蝇防御素的作用机制奠定了基础。     

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

家蝇伴侣蛋白CCTδ基因克隆、序列分析及表达模式的研究

旨在对家蝇伴侣蛋白CCTδ基因进行c DNA克隆、序列分析,并对其时空表达模式进行初步探索。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫c DNA质粒文库中筛选到家蝇CCTδ基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行结构与功能分析,构建系统进化树。取家蝇不同生活史时期虫体(卵、各龄幼虫、蛹、雄雌成虫),3龄幼虫不同组织部位(体壁、气管、唾液腺、脂肪体、马氏管及中肠),采用实时荧光定量PCR分析CCTδ基因在家蝇不同发育阶段和组织部位的表达情况。结果显示,经PCR扩增后,得到了1 600 bp左右的特异性家蝇CCTδ基因片段;CCTδ基因ORF全长1 602 bp,编码533个氨基酸,理论分子量57.16 k D,等电点为7.50;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;进化树分析显示其具有较好的保守性,与中华按蚊的遗传距离较近。时空表达谱显示:该基因在家蝇不同发育时期均有表达,以蛹期表达量最高;在3龄幼虫不同组织中,以气管表达量最高。成功克隆了家蝇CCTδ基因并初步探索了其时空表达模式。     

烟草铜伴侣蛋白NtATX1基因的克隆、生物信息学及表达分析

铜伴侣蛋白ATX(Antioxidant)在维持生命体内铜离子浓度平衡中发挥着重要作用,并且具有一定的镉螯合功能.本研究采用RT-PCR方法从普通烟草中克隆到1个铜离子伴侣蛋白基因,命名为NtATX1.序列分析表明,烟草NtATX1基因的CDS全长354 bp,编码117个氨基酸,包含1个保守的MxCxxC铜离子结合基序,属于HMA亚家族,亚细胞定位于细胞核和叶绿体中,不含跨膜结构域.进化分析显示其与番茄亲缘关系最近.定量PCR结果显示,NtATX1基因在烟草不同组织中均有表达,且在叶片中相对表达量最高,并可受到铜和镉的胁迫诱导,处理后4 d的相对表达量达到最高值,表明其可能在烟草铜离子平衡和镉积累中发挥重要作用.上述结果为后续NtATX1基因的功能研究及利用提供帮助.     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶(LZM)基因进行生物信息学分析,并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从Gen Bank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列,分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因MAF-1-LMZ,将其克隆到原核表达载体p ET-28a中,重组质粒p ET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用IPTG诱导表达,表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示,融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp,编码322个氨基酸残基,理论分子量为35 468.6 Da,等电点为8.31,在大肠杆菌Origmi B/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。     

家蝇防御素基因的cDNA克隆及序列分析

Defensin is a kind of cationic.inducible antimicrobial peptide found in a large range of living organisms that contributes to host defense by disrupting the cytoplasmic membrane of microorganisms.with their broad antimicrobial spectrum and strong pharmaceutical effects.antimicrobial peptides,including defensins,represent a source of novel antibiotic agents.A novel full-length 430 base pairs cDNA of an insect defensin was cloned using polymerase chain reaction (PCR) from the cDnA library of houseflies(Musca domestica) that had been challenged by E.coli and staphylococcus taincd an NH2-terminal signal sequence(1-22)followed by a propeptide and the mature peptide(53-92),The sequence identity with other insect defensin is between 51% and 73%.The mature peptide,with a predicted molecular weight of 4.0kDa,and pI of 8.69,has 1 negative charged amino acid and 4 positice ones,the putative housefly defensin is characterized by 6 invariant cysteine residues forming 3 disulfide bonds,Cys1-Cys4,Cys2-Cys5 and Cys3-Cys6,These results suggest that the novel full-length cDNA of the defensin gene.Denominated Mdde,has been successfully cloned from houseflies.     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源 .根据 3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物 ,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为 76 8bp的mdYP1基因的部分DNA片段 .经地高辛标记成特异性探针 ,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆 ,并从该克隆中分离到大小为 3991bp的mdYP1基因组基因 .序列分析显示 ,该基因组序列含有约1 6kb的 5′ 上游区和 1 0kb的 3′ 下游区 ,编码区由一个 6 1bp的内含子和大小分别为 2 2 2bp和10 2 8bp的 2个外显子组成 .5′ 上游区含有典型的CAAT TATA盒 .     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

解放军军需大学军事兽医研究所夏平安、江禹和中国农业大学生物学院刘维全等研究人员对此课题作了研究,他们认为家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源。根据3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为768bp的mdyp1基因的部分DNA片段,     

家蝇抗菌肽Cecropin-His_6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行序列测定 ;然后用含 6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin -His 6融合基因 ,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1( )中 ;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明 ,RT -PCR扩增得到约 2 30bp的目的cDNA片段 ,与Genebank中报道的家蝇CecropincDNA序列存在一个无义变异差异 (Lys:AAG→AAA) ;6×His标签成功融合到Cecropin的C端。Cecropin -His 6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

绵羊EGFR基因的克隆、表达及序列分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受体家族成员之一,不仅参与细胞增殖、生长和凋亡等多种生命活动,也可调节哺乳动物的乳腺发育及泌乳维持,但对绵羊EGFR基因的序列特征及组织表达情况鲜有报道.本试验以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)及低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)母羊为研究对象,利用RT-PCR、克隆及测序技术获得绵羊EGFR基因完整的CDS区,分析了 EGFR蛋白的结构特征及理化性质,利用RT-qPCR技术研究了基因的组织表达情况.结果表明,绵羊EGFR基因CDS区全长为3 627 bp,编码1 208个氨基酸.绵羊EGFR的氨基酸序列在各物种间较保守,与黄牛EGFR的氨基酸序列同源性最高.EGFR为跨膜蛋白,包含111个磷酸化位点,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.网络互作分析表明EGFR蛋白与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EREG)、双调蛋白(AREG)及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合发挥作用.EGFR主要参与MAPK,PI3K/AKT,JAK/STAT及Wnt信号通路,从而参与了动物的乳腺发育及泌乳功能的调节.RT-qPCR结果表明,绵羊EGFR基因的表达具有组织特异性、时空特异性和品种特异性.该基因在所研究的8个组织中均表达,但在肾脏、卵巢、肝脏、乳腺和肺脏组织中的表达量较高;在小尾寒羊的乳腺组织中,该基因在空怀期的表达量显著高于泌乳高峰期的(P＜0.05);在泌乳高峰期的乳腺组织中,该基因在小尾寒羊中的表达量高于甘肃高山细毛羊的.本试验为深入研究绵羊EGFR基因的泌乳生物学功能提供了基础数据.     

家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式

对家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因SP2、SP13和SP16进行克隆、序列分析和时空表达模式检测。运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Ex PASy)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)等有关的生物信息学分析工具,预测和分析3条Serpin基因编码蛋白质的结构与生物学功能。以RPS18(核糖体S18蛋白)为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测3条Serpin基因在家蝇不同发育时期,以及家蝇3龄幼虫中脂肪体、唾液腺、中肠、马氏管和体壁的表达特征。SP2、SP13、SP16基因序列的开放阅读框ORF全长分别为1191 bp、1137 bp和1212 bp,分别编码含396、378和403个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da,等电点分别为9.01、5.98和6.04,蛋白质的N端都含有一段信号肽,并具有Serpin基因的保守结构域,属于Serpin家族。SP2和SP16在蛋白质的C端含反应中心环(Reactive center loop,RCL),而SP13 C端不含RCL。时空表达模式分析结果显示,SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高,而雄蝇的表达量与卵期相比有所下调;SP13基因在蛹中的表达量最高,1龄幼虫和雌蝇中的表达量与卵期相近;SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高,雄蝇与雌蝇的表达量与卵期相比有所下调。在家蝇3龄幼虫的各主要组织中,以体壁为参照,SP2基因在唾液腺表达水平最高,其次是脂肪体,中肠和马氏管均低于体壁;SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高,中肠和唾液腺的表达量低于体壁;SP16基因在唾液腺、中肠、脂肪体和马氏管的表达量均低于体壁。推测Serpin基因在家蝇个体发育和免疫调节中起不同作用。     

草地螟羧肽酶A基因的克隆、表达及序列分析

羧肽酶是昆虫体内重要的消化酶系之一。利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟Loxostege sticticalis L.中肠cDNA表达文库, 得到编码羧肽酶A的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1 380 bp （GenBank登录号EU924506）, 开放阅读框长1 302 bp, 编码434个氨基酸, 预测分子量和等电点分别为49.1 kDa和9.56。序列含有胰蛋白酶切割位点和催化特征, 具有典型的羧肽酶A特性。将该基因与pET30载体重组后, 经IPTG诱导, 蛋白在大肠杆菌中获得了表达。     

芜菁花青素合成酶基因的克隆、序列分析及表达

目的：克隆津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成酶（ANS）基因并研究其表达特性。方法：用UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆BrANS1和BrANS2基因并进行序列分析,通过Northern杂交检测BrANS1和BrANS2基因的表达。结果：BrANS1和BrANS2的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸残基;BRANS1和BRANS2与甘蓝ANS的同源性达97％,第211-307肽段具有20G-Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域;BrANS1和BRANS2基因具有高度同源性,核苷酸序列在5个位置上存在差异,推导的氨基酸序列完全相同;uv-A可以诱导BrANS1和BrANS2表达,基因的表达量与处理时间相关。结论：克隆了津田芜菁和赤丸芜菁的BRANS1和BrANS2基因,这将为筛选依光型和非依光型花青素生物合成催化酶基因奠定研究基础。     

大熊猫FOXL2基因的克隆、序列分析及表达

从大熊猫基因组中克隆了FOXL2基因,并对其进行序列分析及原核表达和真核表达.将FOXL2编码区序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出FOXL2重组蛋白.成功构建了真核表达载体FOXL2-pcDNA3.1/V5-His C,并通过脂质体介导转染HEK293细胞,Western blot检测FOXL2蛋白表达.SDS-PAGE分析表明,FOXL2重组蛋白在诱导4h后表达量达到峰值,其大小约为58.9 kDa,Western blot分析结果显示重组蛋白能够被抗His单克隆抗体特异性识别.FOXL2基因的克隆及其表达为进一步进行FOXL2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板,通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因（BnGOLS1）启动子片段,长度为827bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明：序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件,以及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS,通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。     

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。     

尼罗罗非鱼TCP-1-beta和TCP-1-eta的分子特征及其低温诱导表达

为了研究尼罗罗非鱼耐寒性状的分子基础并为耐寒品种选育提供参考,研究从尼罗罗非鱼中克隆了HSP60家族TCP-1-beta和TCP-1-eta基因并对其在低温诱导下的表达特征进行了分析。尼罗罗非鱼TCP-1-beta cDNA长度为1755 bp,包括1605 bp的完整开放阅读框,编码534个氨基酸;尼罗罗非鱼TCP-1-eta cDNA长度1651 bp,包括1638 bp的完整开放阅读框,编码545个氨基酸。与其他物种同源基因的蛋白序列比对结果显示,TCP-1-beta和TCP-1-eta蛋白在物种间同源性很高,且都具有保守的ATP结合结构域等,预示其在物种间功能的保守性。实时荧光定量PCR结果表明:TCP-1-beta和TCP-1-eta在各组织中呈遍在表达,但在肌肉中表达量最高;诱导温度从22℃降至12℃,不同低温诱导48h后TCP-1-beta和TCP-1-eta均呈上调表达,在18℃时表达开始上调,随着低温胁迫程度加强,表达上调幅度增大,至12℃时表达量达到最高,TCP-1-beta和TCP-1-eta上调幅度分别达到常温的12.2倍和10.7倍。这些结果预示在尼罗罗非鱼中,TCP-1-beta和TCP-1-eta是潜在的耐寒相关基因。     

小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。