新疆一号冰川土壤细菌多样性的研究*

应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分离PCR扩增的16S rDNA来研究土壤微生物的多样性。直接从新疆一号冰川不同海拔高度的土壤样品中提取总DNA。用两套细菌通用引物分别扩增16S rDNA的V3和V6/V9高变区的特异性片段,PCR产物进行DGGE分析。PCR-DGGE图谱表明,PCR产物经DGGE检测到的条带清晰且分离效果好。结果表明,PCR-DGGE是一种快速研究微生物群落结构的有效方法。     

基于PCR-DGGE技术的红树林区微生物群落结构

【目的】为了解红树林沉积物中细菌的群落结构特征。【方法】应用PCR-DGGE技术对福建浮宫红树林的16个采样站位样品细菌的群落结构进行了研究。根据DGGE指纹图谱,对它们的遗传多样性进行了分析。【结果】各站位样品细菌多样性指数(H)、丰度(S)和均匀度(EH)均有所不同,这些差异与它们所处站位的不同有关,红树林区细菌多样性高于非红树林区细菌多样性。对不同站位细菌群落相似性分析,它们的相似性系数也存在一定的规律,同一断面的细菌群落结构相近性较高。对DGGE的优势条带序列分析,同源性最高的微生物分别属于变形菌门(Proteobacteria)、酸菌门(Acidobacteria)和绿菌门(Chlorobi),它们均为未培养微生物,分别来自于河口海岸沉积物。【结论】应用PCR-DGGE技术更能客观地反映红树林沉积物中真实的细菌群落结构信息。另外,研究也表明红树林区微生物多样性丰富,在红树林区研究开发未知微生物资源具有巨大的潜力。     

PCR-DGGE方法分析原油储层微生物群落结构及种群多样性

使用基于 16 S r DNA的 PCR- DGGE(变性梯度凝胶电泳 )图谱分析结合条带割胶回收 DNA进行序列分析 ,对新疆克拉玛依油田一中区注水井 (12 # 9- 11)和与该注水井相应的两个采油井 (12 # 9- 9S、13# 11- 8)井口样品微生物群落的多样性进行了比较并鉴定了部分群落成员。 DGGE图谱聚类分析表明注水井与两油井微生物群落的相似性分别为 30 %和 2 0 % ,而两油井间微生物群落结构的相似性为 5 4 %。DGGE图谱中优势条带序列分析表明注水井样品和油井样品中的优势菌群为未培养的环境微生物 ,它们与数据库中 α、γ、δ、ε变形杆菌 (Proteobacteria)和拟杆菌 (Bacteroidetes)有很近的亲缘关系。 DGGE与分子克隆相结合的分子生物学方法在研究微生物提高原油采收率 (MEOR)机理 ,以及指导 MEOR在油田生产中的应用有着重要的意义     

茶园根际土壤细菌群落结构及多样性

【背景】茶园根际土壤的细菌群落结构与茶园生境土壤营养循环密切相关,其组成及多样性可以作为健康茶园的一个生物指标。【方法】采用PCR．变性梯度凝胶电泳（PCR—DGGE）分子指纹图谱技术,检测安溪铁观音种植区不同海拔茶园根际土壤样本的细菌群落结构,利用Shannon．Wiener多样性指数分析其多样性,采用非加权组平均法进行聚类分析得到其分布特征,利用蒙特卡罗检验和冗余分析分别揭示影响细菌群落分布的环境因子及细菌群落分布和环境变量之间的关系。【结果】茶园根际土壤细菌的DGGE结果显示,检测到的14种主要细菌中有11种细菌是不可培养的,3种细菌是可培养的,分别属于根瘤菌属、中华根瘤菌属和苍白杆菌属。聚类分析得到,同一海拔梯度茶园根际土壤细菌群落结构相似。Shan-non—Wiener多样性指数分析表明,400m海拔处茶园根际土壤细菌群落多样性最高。蒙特卡罗检验分析得到环境因子协同作用对茶园根际土壤细菌群落结构贡献率为59．6％。冗余分析显示,茶园根际土壤细菌群落结构与海拔密切相关。【结论与意义】茶园根际土壤细菌群落结构分布与海拔梯度密切相关,考虑不同海拔高度土壤细菌群落对茶园营养循环的影响,在铁观音的健康栽培和管理过程中具有重要意义。     

接种微生物菌剂对猪粪堆肥过程中细菌群落多样性的影响

利用PCR-DGGE方法研究了接种外源微生物菌剂对鲜猪粪高温好氧堆肥过程中细菌群落多样性的影响.结果表明：接种外源微生物菌剂可以促进堆肥的顺利进行,比不接种处理的高温期提前2 d.DGGE图谱分析表明,堆肥中优势细菌群落组成发生了明显的更迭现象,不同堆肥时期细菌群落的Shannon-Wiener指数呈显著差异.目的条带克隆测序结果表明,整个堆肥过程Clostridium stercorarium subsp. thermolacticum sp.一直是优势菌属,不经培养细菌、Bacillus coagulans sp.、Clostridium thermocellum sp.在接种外源微生物菌剂处理的第10、16天成为优势菌属,不经培养的Firmicutes sp.和不经培养的 delta proteobacterium分别在未接种外源微生物菌剂处理堆肥发酵的第5天和第16天成为优势菌属.非优势菌属Ureibacillus thermosphaericus、不经培养的Silvimonas sp.出现在堆肥腐熟后期,不经培养的土壤细菌主要出现在堆肥初期和高温初期.UPGMC聚类分析表明,接种外源微生物菌剂明显影响了堆肥不同时期的细菌群落结构组成.堆肥化过程中细菌DGGE图谱主成分分析表明,细菌群落变化主要受外源接种微生物菌剂的影响.     

不同发育阶段杉木人工林对土壤微生物群落结构的影响

采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),分析土壤细菌16S rDNA和土壤真菌28SrDNA特异性片段多态性,研究了不同发育阶段杉木人工林对土壤微生物群落结构的影响.结果表明:土壤微生物群落结构随着杉木人工林的发育年龄而改变,杉木人工林土壤微生物群落多样性和丰富度随杉木生长发育显著增加(P<0.05),但均显著低于次生阔叶林(P<0.05);聚类分析表明,不同发育阶段杉木人工林土壤真菌群落相似性均<60%,而土壤细菌群落相似性最高可达65%,由此可推测不同发育阶段杉木人工林土壤真菌群落结构变化较土壤细菌群落结构变化剧烈;相关性分析表明,不同发育阶段杉木人工林土壤速效氮、碳氮比与土壤微生物群落多样性显著相关(P<0.05).本研究表明,长期种植单一杉木人工林能够通过改变土壤理化性质来影响土壤微生物群落组成,进而影响森林生态系统养分循环,导致人工林林分生产力下降.     

厦门海域2011年中肋骨条藻和血红哈卡藻赤潮期间细菌群落结构变化

【目的】研究2011年8月厦门海域爆发的由中肋骨条藻和血红哈卡藻共同引发的赤潮生消过程中细菌群落结构变化。【方法】应用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)对两个赤潮站位和一个非赤潮站位的细菌群落结构进行研究。通过DGGE图谱分析确定赤潮生消过程中细菌群落中的关键菌群,借助Canoco软件分析细菌菌群与环境因子的相关性。【结果】在赤潮起始阶段细菌的群落结构与pH、N/P的相关性较大,在赤潮消亡阶段细菌的群落结构与盐度、温度呈明显的正相关。γ变形杆菌(Gammaproteobacteria)(47.7%)在赤潮期间处于主导位置,假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、Actibacter、Oleibacter等属均为优势菌群。香农-威列多样性指数表明,赤潮站位细菌多样性随着赤潮生消呈先升高后降低趋势,而非赤潮站位细菌多样性基本保持不变。通过Canoco对细菌菌群的主成分分析发现,在赤潮开始阶段Hydrogenophaga属为优势菌群,而在赤潮消退阶段则以Pseudomonas和Pseudoalteromonas属为主。赤潮站位藻际细菌和游离细菌群落多样性在藻密度较大时均达到最大值,然而两者与环境因子的相关性有较大差别。【结论】研究结果表明赤潮站位细菌群落多样性远高于非赤潮站位,细菌丰度随着赤潮藻密度的升高而增加,细菌与赤潮藻有着密切的关系。本文首次研究了多种优势藻引发的赤潮环境下细菌群落结构的变化,这对于多种藻引发的赤潮生消过程中细菌菌群结构有了深入的了解,为赤潮调控的研究提供了理论依据。     

农肥和化肥施用对大豆根瘤菌多样性的影响

基于6年的黑土培肥定位试验,从大豆根瘤中提取根瘤菌DNA,采用PCR-DGGE与克隆测序技术相结合的方法,分析了施用农肥和化肥对根瘤菌多样性的影响。DGGE图谱分析表明:对照(不施肥)处理的nifH基因条带数和多样性指数最大,各处理多样性指数差异显著,大小顺序为:对照>农肥高量>农肥低量=农化1:1>化肥高量>化肥低量。聚类分析显示,施用化肥的处理与其他处理相似性仅为66%,说明施用化肥的处理与其他处理相比大豆根瘤菌群落结构差异较大,显著改变了根瘤菌的群落结构。DGGE测序结果显示,大部分根瘤菌属于慢生根瘤菌属。农肥和化肥的施用均降低了大豆根瘤菌多样性,其中化肥处理更明显地降低了根瘤菌多样性。     

非培养方法解析北京地区甘薯叶际细菌的群落结构

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术和磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法,比较了北京通州、顺义、昌平、延庆地区甘薯叶际细菌的多样性和生物量,并调查了通州地区甘薯叶际细菌群落在不同生长季节的变化情况。PLFA分析结果发现所有检测样品中,革兰氏阳性细菌生物量均高于革兰氏阴性细菌生物量。PCR-DGGE方法与PLFA方法聚类分析结果较一致,甘薯叶际细菌群落结构受到时空因素、甘薯生理特性等的影响,不同地点、不同生长季节甘薯叶际细菌群落结构有较大差异,DGGE条带测序分析表明,Pseudomonas sp.在不同地点的甘薯叶际均为保守菌群,Bacillus sp.,Acinetobacter sp.,     

抗草甘膦转基因大豆（RRS）对根际土壤细菌数量和多样性的影响

为深入研究种植抗草甘膦转基因大豆的黑土生态区根际土壤中细菌数量及多样性的变化,试验采用DGGE-cloning测序技术与传统培养相结合的方法,研究了抗草甘膦转基因大豆(RRS)对根际土壤细菌数量以及细菌群落多样性的影响.传统培养试验结果为RRS显著降低了土壤细菌的数量;DGGE图谱分析表明,RRS根际土壤细菌16SrDNA条带数、多样性指数及均匀度指数均要低于其他处理,聚类分析显示RRS带谱与RRS-S和Y-S差异较大,相似性分别为64%和64.4%;DGGE-cloning测序结果表明,在RRS处理中缺失条带1和条带12分别属于Uncultured bacterium和Nitrospira门Nitrospira属,其中条带1与其他切取条带最小遗传距离达0.4,与其他处理相比表现出弱势差异的条带2、4、5和条带11均属于Uncultured bacterium.研究表明,RRS不同程度上降低了根际土壤细菌的数量和细菌群落的多样性,并对根际土壤中Nitrospira属细菌有一定的抑制作用.     

两株芽孢杆菌对黄瓜和番茄根际土壤微生物群落结构影响

采用聚合酶链式反应/变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE),研究了盆栽条件下,接种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对不同时期黄瓜和番茄根际土壤微生物群落结构的影响.通过DGGE图谱的主成分分析表明,这2株生防菌对根际微生物的影响因作物的种类不同而不同:对黄瓜根际细菌和真菌群落结构均无显著影响,真菌群落随着取样时期而发生明显变化;对番茄根际细菌群落结构无明显影响,但不同采样时期细菌群落结构发生明显变化,而2株生防菌对其真菌群落结构的变化有显著影响.蔬菜种类是决定根际微生物群落结构的主要因素,接种生防细菌对根际细菌群落结构影响不显著,而对根际真菌群落结构的影响因蔬菜种类的不同而有差异.     

舌苔细菌PCR-DGGE分析条件的建立与优化

目的针对口腔舌苔细菌16S rDNA序列进行变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)适用序列的筛选及电泳条件的优化。方法以DGGE图谱的高分辨率为指标,选择舌苔细菌DGGE分离最适的16S rDNA高变区、电泳电压和电泳时间,并采用优化的条件分析健康青年人舌苔细菌群落的分布。结果舌苔细菌16S rDNA V3高变区引物序列能获得更加丰富清晰的DGGE条带;基于该区,当变性剂浓度为30%～60%、电泳温度60℃、电压60 V和电泳时间14 h时能得到分辨率最佳的DGGE图谱。运用此优化条件对12个样本舌苔细菌群落的分析表明,舌苔微生物主要由厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门和变形菌门等组成。优化后的DGGE技术对舌苔细菌多样性的分析具有准确性、灵敏性和可重复性。结论 DGGE图谱显示,不同分析条件对图谱类型和细菌多样性指数均有所差异。利用优化的DGGE条件能有效分离舌苔细菌16S rDNA V3区序列,为口腔微生物群落结构分析提供可靠的技术支持,也为其他不同生态细菌的多样性分析提供参考。     

云南腾冲热海两热泉菌藻席细菌多样性的研究

应用显微形态观察和变性梯度凝胶电泳(DGGE)对云南腾冲热海两热泉菌藻席的细菌多样性进行了比较分析.直接从环境样品中提取总DNA,用两套细菌通用引物进行PCR扩增,得到包含V8和V9高变区的16S rDNA片段,进行DGGE分析,结合形态观察,结果显示,热泉菌藻席中存在丰富的细菌多样性,且不同温度范围的菌藻席细菌组成差异显著.     

DGGE分析东江流域农村饮用水源中微生物多样性及其与环境因子相关性

为评价东江流域农村饮用水源中微生物多样性及其与环境因子的相关性, 分别采集了集中式供水井、塘坝型水井、猪场附近水井、普通村落水井、水库水5种水样, 进行基因组总DNA的提取和主要理化指标的测定, 运用DGGE技术分析各水样总DNA的PCR产物。UPGMA聚类分析DGGE指纹图谱结果表明, 相同类型水样的微生物群落结构相似性较高, 聚集到一个分支上; 典型相关性分析(CCA)结果表明, 水体中总磷(TP)和总氮(TN)的浓度与微生物群落结构的关联度最高, 即磷和氮两种生命过程的基本元素对微生物群落影响最大; 序列分析表明农村饮用水源中微生物群落结构丰富, 包含了螺旋体门(Spirochaetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)5个门的细菌, 且每类水样拥有各自的优势菌。     

应用PCR-DGGE技术分析BKS-2型糖尿病模型小鼠盲肠内容物微生物菌群结构

通过对BKS-DB 2型糖尿病小鼠盲肠内容物微生物群落结构的分析,探讨基因突变模型鼠肠道微生物群落与糖尿病发生的相关性。提取BKS-DB 2型糖尿病小鼠与同窝对照小鼠盲肠内容物细菌总DNA,PCR扩增16S rRNA基因V3区,DGGE方法检测扩增产物,并挑选特异条带测序,对图谱作UPGAMA聚类分析,运用SPSS软件分析多样性。结果显示,UPGAMA聚类分析表明,对照组样本之间相似度0.66-0.91,糖尿病组样本之间相似度0.61-0.88,两组之间最高相似度为0.51。特异性条带测序后经比对与Parabacteroides菌属亲缘关系最近。SPSS统计分析糖尿病组和健康对照组小鼠的DGGE条带数、多样性指数(H’)、丰富度(R)和优势度(D)的差异性显著,具有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组小鼠与对照组小鼠的盲肠内容物微生物群落多样性存在差异,糖尿病对肠道微生物的多样性有影响。     

云南腾冲热海三热泉细菌多样性的研究

应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对云南腾冲热海3个高温热泉中菌藻席和泉底沉积物的细菌多样性进行了初步研究。直接从环境样品中提取总DNA,用两套细菌通用引物进行PCR扩增,分别得到包含V8和V9高变区的16SrDNA片段,进行DGGE分析。结果表明：菌藻席和泉底沉积物中不仅物种组成差异较大,而且都存在丰富的细菌多样性;一些关键的生态因子,如氧气、温度等会对群落中微生物的物种组成有很大影响。     

坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性

摘要:【目的】坛紫菜是我国江浙海区栽培地主要经济藻类。观察紫菜养殖过程中藻际微生物的群落特点及变化,研究藻际环境中的微生物因素在紫菜栽培中的作用,为保证紫菜健康生长及病害防治提供理论与实验基础。【方法】采用传统纯培方法和PCR-DGGE 技术分离归类坛紫菜养殖周期中的藻际微生物,并利用16SrDNA (细菌)和18S rDNA(真菌)序列测定及在线BLAST比对鉴定到属,比较分析不同生长阶段、不同养殖海区及养殖过程的坛紫菜藻际微生物的多样性特点。【结果】在坛紫菜养殖过程中总共分离到467株细 菌,共41个属。分类结果显示藻际细菌归属于变形菌门(Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),优势菌群为α-变形菌纲和γ-变形菌纲。分离到55株真菌,共15个属。分类结果显示绝大多数真菌归属于子囊菌门(Ascomycota),仅1株归属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)。细菌多样性大于真菌。坛紫菜藻际细菌有19个特异菌属,对照海水细菌有13个特异菌属;从丝状体中分离到大部分真菌和放线菌,坛紫菜养殖丝状体和不同叶状体养殖阶段的藻际微生物类别差异明显。在分离的坛紫菜藻际微生物中发现了与引起细菌性红烂病的海科贝特菌(Cobetia marina)、引起白斑病的紫菜茎点菌(Phoma porphyrae)高度相似的菌株,以及与典型的腐霉如镰孢霉菌(Fusarium sp.)和曲霉(Aspergillus sp.)高度相似的菌株。【结论】坛紫菜养殖过程中藻际微生物的多样性受到紫菜生长形态、养殖时间及养殖环境等因素的影响。在藻际微生物中发现与紫菜致病菌高度相似的微生物,作为潜在致病微生物应得到重视。     

5株北极微藻藻际环境的细菌多样性

对5株北极微藻,如脆杆藻(Fragilariopsis sp.)、微单胞藻(Micromonas sp.)、四棘藻(Attheya septentrionalis)、海链藻(Thalassiosira sp.)和小球藻(Chlorella sp.)的不同生长时期的粘附细菌和游离细菌的16S rRNA基因进行PCR-DGGE分析,研究藻际环境的细菌多样性。结果表明,5株微藻具有不同的藻际微生物群落结构组成,其中微单胞藻、脆杆藻、四棘藻和海链藻的藻际细菌主要由Cyanobacteria(藻蓝细菌)、α-Proteobacteria(α-变形菌纲)和γ-Proteobacteria(γ-变形菌纲)组成,仅微单胞藻和脆杆藻检测出CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides,噬纤维菌-屈挠杆菌-拟杆菌)。小球藻由Cyanobacteria、CFB、α-Proteobacteria和β-Proteobacteria(β-变形菌纲)组成。微单胞藻的藻际菌群结构稳定,不同生长时期的游离细菌和粘附细菌组成差异不明显。3株硅藻-脆杆藻、四棘藻和海链藻的游离细菌主要由γ-Proteobacteria组成,小球藻的游离细菌主要为β-Proteobacteria,而5株微藻的粘附细菌主要由Cyanobacteria组成。从DGGE图谱来看,在脆杆藻生长的延滞期、指数期和稳定期,其藻际游离细菌和粘附细菌的16S rRNA基因扩增条带数量和位置均有明显差异,但优势扩增条带较稳定;其他4株藻粘附细菌和游离细菌的扩增条带比较稳定,说明藻际关联菌群结构较稳定。藻菌种间特异性关系为不同微藻藻株提供了重要的线索,同时也带来更多的隐藏在藻际环境中的信息。     

PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究

采用PCR-DGGE分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、奠愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构,研究结果表明,三湖泊沉积物微生物的16SrDNA的PCR扩增结果约为626bp,为16S rDNA V3～V5区特异性片段。玄武湖和莫愁湖表层沉积物中大约有20种优势菌群,且同一湖泊不同采样点DGGE图谱的差异性不大,细菌群落结构具有较高的相似性,而太湖样品DGGE条带的数目和位置表现出明显差异,且不同采样点图谱的差异性较大。三湖泊除具有特征性的微生物种属外,还分布约5个相同的细菌种群,可能与沉积物的理化性质和水生植被的影响相关。对DGGE图谱中7条主带进行回收、扩增和测序,结果显示其优势菌群具有不同的序列组成,其中5个序列与Genebank中已登录的细菌种群的同源性≥99％,2个序列的同源性为96％和93％,其中2个相似的细菌类群目前尚未获得纯培养。     

应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是通过核酸片段对微生物群落进行研究,可以监测未培养细菌及其功能基因,被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析,并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了DGGE操作过程中遇到的常见问题,并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和PCR扩增效果对DGGE分析的影响,探讨了DGGE图谱的优化过程和图谱分析方法,并对DGGE的应用前景进行了综述。