玉米籽粒酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmSCL1互作因子筛选

ZmSCL1属于GRAS家族基因,在玉米籽粒,尤其是胚乳中高表达,而这个时期是玉米灌浆的关键时期,鉴于ZmSCL1的分子功能以及其与玉米籽粒发育的关系尚不明确。利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株AH109中构建了玉米自交系B73授粉后不同时期籽粒的c DNA文库,利用此文库筛选了ZmSCL1的互作因子。文库质量评定结果显示:c DNA文库的滴度为1.10×105 CFU/m L,文库的库容量为1.32×106,文库的重组率为81.90%,插入片段所编码的蛋白质长度在133-500个氨基酸之间。最终,获得了190个阳性克隆。对这些克隆进行测序,利用GO注释对所筛选的互作因子进行初步分类,并进行功能富集分析。结果显示ZmSCL1可能参与结合、催化以及营养储备相关生物过程的调控。     

人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库的构建与鉴定

[目的]构建人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖道感染病原体的相互作用奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出mRNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,T7噬菌体展示c DNA文库构建成功。[结果]将文库扩增后,用噬斑试验检测其库容,结果为1.2×106pfu/cm3。用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。[结论]成功构建了SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为下一步研究泌尿生殖道感染病原体与人尿道上皮细胞的相互作用奠定了前期实验基础。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。     

莱茵衣藻基因组文库的构建

以莱菌衣藻CC-849为材料,提取基因组DNA,利用BamHⅠ和BglⅡ对基因组DNA进行酶解,获得了可用于构建基因组文库的6-12 kb的基因组片段,并浓缩至200 ng/μL。该片段与λDNA载体连接,经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌XL1-blue后,获得了莱菌衣藻基因组文库。该文库的滴度为2.12×10~5 pfu/mL,共有转化子4.26×10~4个,插入片段的平均长度约为9kb,扩增后基因组文库滴度为9.5×10~6 pfu/mL。     

酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的筛选与Rap GAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的Rap GAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的c DNA文库作为靶蛋白,应用p PC97、p PC86组成的酵母双杂交系统筛选c DNA文库中与Rap GAP相互作用的蛋白质。结果通过营养缺陷平板(-LTH)筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4~10个克隆,通过Sal I和Not I双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与Gen Bank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为Rap GAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论初步筛选出与Rap GAP相互作用的蛋白质,特别是其中有2个克隆为Rap GAP,提示Rap GAP可能以二聚体的方式存在。     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

中华大蟾蜍精巢组织全长cDNA文库的构建及泛素延伸蛋白基因Bg-ubi52的获得

运用SMART技术构建了中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)精巢全长cDNA文库。提取中华大蟾蜍精巢总RNA,用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长cDNA双链;经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,500bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装,建成原始文库。经鉴定,原始文库滴度为2.21×106pfu/ml,重组率为91%;文库扩增后的滴度为2.94×109pfu/ml,重组率为93.7%。插入片段大小分布于0.4~2.0kb之间,平均长度约为1.0kb,说明已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因,全长561bp,包含完整的5′和3′非编码区,编码128个氨基酸,即泛素的76个氨基酸后融合了52个氨基酸的核糖体L40蛋白。     

利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白

目的:克隆人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。结论:获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。     

核定位信号筛选系统的构建

建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有 NLS的蛋白质的基因     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

新生隐球菌酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

目的构建新生隐球菌H99细胞酵母双杂交cDNA文库,为后续深入研究新生隐球菌的蛋白功能以及病原-宿主相互作用机制奠定基础。方法提取对数生长中期的隐球菌细胞mRNA,以5’端标记有Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库。结果入门文库总容量为1.13×10~7 CFU,阳性率为90.63%。表达文库总容量为1.25×10~7 CFU,阳性率100%。结论构建的表达文库具有较高的质量,此文库可用于研究新生隐球菌的蛋白互作机制,筛选与宿主蛋白相互作用的隐球菌蛋白,为新生隐球菌的分子致病机制研究奠定基础。     

夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

为构建高质量的夜香树(Cestrum nocturnum)均一化全长c DNA文库,以其花朵为材料,采用DSN均一化技术与改进的SMART技术相结合,将连接产物进行脱盐浓缩后电转化进行构建。结果表明,未脱盐连接产物的转化效率为1μL连接产物有7000个菌落,理论重组率为96%;脱盐后,提升为4.1×106个菌落,理论重组率为98%;蓝斑也有插入片段,实际重组率应为100%;插入片段大小平均为1.6 kb。随机挑取500个单克隆(含50个蓝斑)测序,共获得464条EST,单一序列(unigene)为426条,占91.8%,其中片段重叠群26个,单基因400个,冗余率仅为8.1%,表明构建文库的均一化效果较好,可满足后续功能基因的筛选和基因信息的研究。     

类泛素蛋白FAT10对人肾上皮细胞α-烯醇酶共价修饰的初步研究

目的:构建带Flag标签的α-烯醇酶(ENO1)基因以及带Myc标签的人白细胞抗原F相关转录物10(FAT10)基因的真核表达质粒载体,鉴定ENO1和FAT10在人肾上皮细胞株HEK293中的表达,检测类泛素蛋白FAT10是否共价修饰ENO1。方法:以人宫颈癌细胞系He La的c DNA为模板进行PCR,得到eno1目的片段,与分别经EcoRⅤ和SalⅠ酶切的pFlag-CMV载体连接得到重组质粒pFlag-CMV-eno1并进行鉴定测序;以人脑组织c DNA文库为模板进行PCR,得到fat10目的片段,与分别经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切的p CMV-Myc载体连接得到重组质粒p CMV-Myc-fat10并进行鉴定并测序。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,用Western印迹检测ENO1和FAT10蛋白的表达。将重组质粒共转染HEK293细胞,用免疫共沉淀检测FAT10对ENO1的修饰情况。结果:重组克隆载体内的eno1和fat10序列与Gen Bank报告的序列完全一致;转染HEK293细胞后,ENO1和FAT10蛋白过表达;FAT10能够共价修饰ENO1。结论:类泛素蛋白FAT10共价修饰ENO1,为肿瘤的发生、发展及迁移的研究提供了新的研究思路。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

海洋放线菌Streptomyces sp.大片段DNA基因组文库的构建

目的:构建稀有海洋放线菌Streptomyces sp.基因组文库.方法:以稀有海洋放线菌Streptomyces sp.为实验材料,随机剪切提取的总DNA,5'-磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段,与pWEBTM载体连接,经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E.coli EPI100,构建该菌株的基因组文库,并对该文库进行质量鉴定.结果:成功构建了稀有海洋放线菌Streptomyces sp.的基因组文库,效价达9.0×104CFU/mL,得到4000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99%计算至少所需的837个阳性克降子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率100%.阳性克隆子保存于96孔板中,-80℃保存.结论:所构建文库的各项指标均达到要求,为了进一步评估Streptomyces sp.所能合成的所有潜在天然产物,还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况.     

H-Ras结构域的原核表达及纯化

目的:克隆人H-Ras部分片段基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从质粒Myc-H-Ras中扩增H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)结构域片段,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从Myc-H-Ras质粒中分别扩增获得约500和100 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别为46×103和29×103的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189)。结论:获得了重组蛋白GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189),为后续深入研究H-Ras影响肿瘤细胞生长的机制奠定了实验基础。     

耐辐射奇球菌基因组DNA表达文库的构建与鉴定

目的:构建耐辐射奇球茵(Dcinoeoccus radiodurans R1)基因组DNA表达文库,为进一步研究耐辐射奇球茵高抗辐射的调控网络奠定基础.方法:提取耐辐射奇球菌基因组DNA,用Sau3AI酶将基因组DNA部分酶切成0.5-5 kb大小的片段,用T4DNA连接酶将部分酶切片段与经BamH I和碱性磷酸酶(CIAP)处理的pGADT7栽体进行连接后电击转化大肠杆菌DH5a.结果:得到重组子数为2.2×104,扩增后的文库滴度为108 cfu/mL.结论:构建了耐辐射奇球菌基因组pGADT7表达文库,为进一步筛选与高抗辐射相关基因产物的互作蛋白奠定了基础.     

虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库的构建

从 2 5只虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)中得到约 0 .6g左右的毒腺 ,从中提取出5μg m RNA.以此 m RNA为模板 ,经反转录合成双链 c DNA.再经包装成 c DNA文库 .文库的滴度达到 3.2× 1 0 7pfu/m L     

绵羊精子赤道膜蛋白片段1(SPESP1)的克隆、原核表达及纯化

旨在克隆绵羊Spesp1 c DNA并表达,得到纯化的GST-SPESP1融合蛋白。以绵羊睾丸组织总c DNA为模板,根据Gen Bank公布的绵羊基因组序列设计引物,PCR扩增得到Spesp1 c DNA,构建原核表达重组载体p GEX-Spesp1,将其转化到E.coliBL21中表达,并优化其表达条件,利用SDS-PAGE切胶纯化法得到纯化的融合蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果表明,经测序,克隆得到的Spesp1 c DNA序列与Gen Bank中预测的c DNA序列对比有两个碱基不同,并造成一个氨基酸的差异。在E.coliBL21中成功表达重组融合蛋白,其最优表达条件为:37℃、4 h、0.005%IPTG终浓度,SDS-PAGE和Western blotting中,融合蛋白位于约64 k D处并可以被抗GST和抗羊SPESP1的抗体识别,与预计相符,表明融合蛋白成功表达。成功纯化得到GST-SPESP1融合蛋白,为研究SPESP1在精卵细胞膜融合中的功能奠定了基础。