马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

本文报道应用聚合酶链式反应(PCR)技术,在体外扩增马铃薯 Y 病毒外壳蛋白基因及其克隆和序列分析的结果。病毒 RNA 从马铃薯 Y 病毒感染的烟草叶片中提取,用合成的PCR 3引物及 AMV 逆转录酶合成了单链的 cDNA。利用 PCR 技术,经30个循玎的扩增。得到了一特异的0.8kb 片段。克隆后对此片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,并测定了其全序列。实验结果证明,我们克隆到的是完整的马铃薯 Y 病毒的外壳蛋白基因。与国外报道的马铃薯 Y 病毒 N 株相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为97.8%和97%。将该基因导入马铃薯以期获得抗 Y 病毒马铃薯的工作正在进行。本文还对 PCR 技术用于扩增植物 RNA 病毒的方法以及用基因工程方法培育抗病毒作物新品种的可行性等进行了讨论。     

重庆烟草地区ELISA检测

为调查重庆主要烟草地区的病毒病种类,采用没脸免疫吸附法(ELISA)对采自重庆涪陵、彭水、万州、黔江、武隆、酉阳的258份的烟草样品进行了病毒病种类的检测.检测结果表明,其中274份样品呈阳性。主要受到7种病毒病的侵染,主要包括:烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)。其中TMV的检出率最高,达50%,已成为重庆地区烟草优势病原。     

马铃薯Y病毒N株HC-pro基因的序列分析与表达

马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死株系（PVY-N)为主,重病田发生率达40%以上,并常与烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒混合侵染,严重影响烟草品质造成巨大的经济损失.     

臭氧(O_3)浓度升高导致抗性品种的抗性下降

<正>昆虫传播的植物病毒往往给作物造成巨大的经济损失,因此选育具有抗病毒的作物品种是目前防治病毒危害的重要手段之一。当前,随着现代化进程的加快,近地面臭氧(O3)浓度不断升高。但这种变化对作物抗性品种的影响如何,目前仍不清楚。中国科学院动物研究所戈峰研究员领导的种群生态与全球变化研究组模拟研究了近地面臭氧(O3)由目前40ppb浓度增加到未来80ppb情景下植物对蚜传病毒的作用。以抗马铃薯Y病毒(PVY)的烟草品种和常规对马铃薯Y病毒(PVY)敏感的烟草品种为     

毒源烟草试管保存技术的研究

经三年连续试验,用试管保存含马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)的毒源烟草,结果证明毒源烟草可在试管中正常生长发育。负染法和免疫电镜捕获法检测结果证明,试管毒源烟草不同生育期,体内的病毒含量不同;试管毒源烟草在管外土壤中栽培可正常生长发育,并表现出相应的症状,接种指示植物试验证明其侵染力与温室内保存的毒源效果相同。     

广东省烟草花叶病病原病毒的鉴定

烟草花叶病是广东省产烟区的主要病害之一。我们在南雄等八个县进行调查,1983年至1984年的一般发病率为2～20％。根据血清学反应、病毒粒体形态、鉴别寄主反应及寄主范围、媒介昆虫种类、物理性质、交互保护反应等各项检验结果,鉴定广东省烟草花叶病病原是:三个黄瓜花叶病毒可能株系(普通株系CMV-C,烟草坏死株系CMV-TN,烟草黄色坏死株系(CMV-TYN),烟草花叶病毒(TMV),马铃薯病毒Y(PVY),烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和烟草褪绿斑驳病毒(TCMV)(暂定)。     

不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析

文章以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY) P3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的PVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过P3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数F_ST分别为0.116和0.120,且统计检验差异显著,表明烟草和马铃薯寄主的PVY之间中度分化。变异分析结果显示,烟草分离物P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为85.2%~100%和76.5%~100%,而马铃薯分离物的P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为95.7%~100%和93.0%~100%,表明烟草PVY变异程度高于马铃薯。同时,P3基因内检测到大量的净化选择位点,表明该基因大部分位点的变异为有害突变,在进化过程中被剔除。此外,P3基因内还检测到两个显著正向选择位点,表明这两个位点的变异为有益突变,有利于病毒的生存竞争。在pipo基因中未检测到显著的选择位点,表明该基因上的变异基本不受自然选择影响。通过P3和pipo基因计算烟草和马铃薯群体间的基因流Nm值分别为1.91和1.83,表明这两个群体间存在较强的基因交流。以上结果表明,来源于烟草和马铃薯寄主的PVY遗传差异显著,突变、自然选择以及基因流都影响两者的遗传多样性及遗传分化程度。     

烟草曲茎病毒Y128分离物及伴随卫星的分子鉴定*

从云南保山田间表现曲叶症状的烟草植株上分离到病毒分离物Y128,病株在实验室可经烟粉虱(Bemisiatabaci)传播到健康烟草上。分别用针对烟草曲茎病毒(TbCSV)、云南烟草曲叶病毒(TLCYNV)、中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)等田间常复合侵染的云南粉虱传双生病毒的特异性引物对Y128DNA-A进行PCR扩增,结果表明Y128是烟草曲茎病毒(TbCSV)的1个分离物。利用DNAβ的特异性引物β01和β02,在Y128中扩增到卫星DNA分     

烟草曲茎病毒Y128分离物及伴随卫星的分子鉴定

从云南保山田问表现曲叶症状的烟草植株上分离到病毒分离物Y128,病株在实验室可经烟粉虱（Bemisia tabaci）传播到健康烟草上。分别用针对烟草曲茎病毒（TbCSV）、云南烟草曲叶病毒（TLCYNV）、中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）及泰国番茄黄化曲叶病毒（TYLCTHV）等田间常复合侵染的云南粉虱传双生病毒的特异性引物对Y128 DNA-A进行PCR扩增,结果表明Y128是烟草曲茎病毒（TbCSV）的1个分离物。利用DNAβ的特异性引物1301和1302,在Y128中扩增到卫星DNA分子（Y128β）。对Y128进行DNAβ全序列测定及分析表明,Y128β拿长1350个核苷酸,其互补链上编码1个有功能的ORF（βC1）。Y128β的全序列与TbCSV各个分离物的卫星分子（Y2β、Y35β和Y115β）的同源性最高,分别为85．2％、94．3％和88％;与其它已报道的卫星DNAβ的同源性均低于56．1％。     

植物遗传工程

920268抗病毒植物的遗传工程〔英〕/Godoni,F一ZAreh.Virol一2990,115(i一2)一i~22〔译 自DBA,1991,10(9),91一05050] 讨论的主要内容包括:用于交叉保护的外壳蛋 白序列对植物的转化,表达病毒外壳蛋白的转基因植物的田间试验,抗病毒侵染的反义RNA技术,病毒卫星RNA在植物中的表达,ribozyme和锤头RNA机制,作为受体专性抗病毒荆的抗个体基因型的抗体;人干扰素基因在转基因植物中的克隆和表达。构建了抗下列病毒的转基因植物,烟草花叶病毒、首藉花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒等。外壳蛋白介导的保护是最广泛采用的…     

马铃薯块茎中总RNA的快速提取

马铃薯块茎中由于含有大量的多糖和酚类物质,因此难以从中提取RNA。本实验采用CTAB法从马铃薯块茎中提取了总RNA,并进行了马铃薯病毒的检验。结果表明:得到的RNA完整性好,A260/A280在1.7～2.0范围内,纯度也比较高。用RT-PCR方法进行马铃薯Y病毒的检验,得到了一条与预计扩增长度相同的一条带,并检验出枣庄地区马铃薯Y病毒的感染率为75%。     

马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用

构建了马铃薯Y病毒中国株系（PVY－C）蚜传辅助成分（HC－Pro）基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89。Southern blot分析表明,HC－Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中,Western blot分析证明,正义HC－Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物,攻毒试验结果表明,转正义,HC－Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY－C的病毒积累和致病,而且对异源病毒PVX具有同样的作用,而转反义HC－Pro基因烟草对PVY－C和PVX的致病性无影响,因此,PVY－C HC－Pro基因介导PVX／PVY的协作作用。     

番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

近二年报道,在TMV^⑴、PVX^⑵、PEBV^⑶和CMV^⑷等病毒中,利用病毒编码的复制酶(亚基)基因或相关cDNA片段转化烟草,工程植株获得绝对或极高的病毒抗性。大量研究认为：马铃薯Y病毒组的核内含体大分子量蛋白(Nib)是依赖于RNA的RNA复制酶(或核心亚基),Nlb与上述病毒的复制酶有广泛的同源保守区^⑸。因此,Nib基因的克隆,不但在植物抗病基因工程方面,而且在马铃薯Y病毒组基因组的复制研究方面．均有重要的意义。本文以马铃薯Y病毒组的重要成员番木瓜环斑病毒的华南强株系(PRSV—sM)为材料,克隆了PRSV的Nib基因,并完成其全序列测定和植物表达载体的构建,为探索马铃薯Y病毒组复制酶可能介导的抗病性打下了基础。     

烟草NtWRKY40在植物应答病毒侵染过程中的作用

WRKY转录因子家族在植物的抗病、抗逆反应中具有重要功能。已有研究表明,烟草花叶病毒(TMV)的侵染显著地诱导烟草Nt WRKY的表达,有必要进一步探明该基因在植物应答病毒侵染过程中的作用。采用PCR的方法克隆获得Nt WRKY cDNA,生物信息学分析结果显示,该基因属于WRKYⅡa亚族成员,与绒毛状烟草NtoWRKY40高度同源,命名为NtWRKY40。以此建立了过表达该基因的转基因烟草,并以TMV为毒源进行了转基因烟草和野生烟草的侵染实验,以观察NtWRKY40在烟草应答病毒侵染过程中的作用。实验结果表明,野生烟草在TMV侵染后9 d,NtWRKY40的表达量显著升高,而NtWRKY40过表达转基因烟草在病毒侵染后,病毒相关基因的表达高于野生型对照,与染病程度成正相关,说明过表达NtWRKY40增加了植株对病毒的敏感性,该基因为负调控因子。此外,为探索应用人工miRNA的抗病毒技术,以烟草天然miR167前体为骨架、马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的一段反向互补序列为成熟序列,构建了amiR167-PVY植物表达载体并转化烟草,以抑制PVY。对amiRNA转基因植株进行抗病毒实验的结果显示,amiR167-PVY能够部分抑制病毒基因的表达,转基因植株具有一定的抗病毒能力。     

乳胶溶液电镜在检测线状和棒状植物病毒中的应用

建立了一种检测线状或棒状植物病毒的新的电镜技术。用聚苯乙烯乳胶预先包被铜网用以测定烟草花叶病毒,马铃薯X、Y病毒,玉米矮化花叶病毒表明,铜网上沾附的病毒数量与免疫电镜法相似,比直沾法多几倍至十几倍。乳胶溶液电镜法不需制备特异抗血清,方法简便快速,特别适合于植物样品的初次病毒检测工作。     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因在转基因烟草植株中的表达及抗病

通过根癌农杆菌介导的叶盘法,将马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因导入烟草细胞并获得大量再生的转基因烟草植株。经胭脂碱检测、酶联免疫分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,证明已获得了具有马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因表达的转基因烟草。用２μｇ／ｍｌ的ＰＶＸ磨擦接种烟草,８天后进行观察,发现对照植株开始发病,而转基因烟草植株在２０后才开始发病,有的转基因烟草植株在整个生长期中都不得病。对ＰＶＸＣＰ基因表达量较高的４株植     

四种广普性植物病毒高效mPCR检测方法的建立

本研究建立了能同时检测出烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重RT-PCR体系。TMV、CMV、PVX、PVY是四种广普性植物病毒,寄主范围广泛,并且常常发生复合侵染。本研究以上述四种病毒的CP基因部分序列设计引物,以反转录的cDNA为模板,建立多重RT-PCR反应体系,分别扩增出211～417bp的不同长度的基因片断,并通过序列测定来确认扩增序列的特异性。将反转录合成的cDNA进行浓度稀释,来对多重RT-PCR与单重RT-PCR的灵敏度进行比较,结果证明,多重RT-PCR体系能够同时快速检测这四种病毒,并且有很高的灵敏度。     

马铃薯Y病毒蚜传辅助因子促进马铃薯X病毒长距离运输

采用PCR和定点突变法,对马铃薯Y病毒中国株系（Chyinese strain of potato Ypotyvirus,PVY-C)蚜传辅助成分（helper component proteinase,HC-Pro)基因中心区域的CCCT基序和PTK基序进行定点改造,获得了4种突变体。然后将突变体砍降到植物表达载体pBin438中,所得到的重组体通过根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Conn）介导法转了烟草（Nicotiana tabacum L.cv.K326).Southern blotting和Western blotting分析表明4种突变体已经成功整合到烟草的基因组中,并在蛋白水平上得到了表达。马铃薯X病毒（potato X potexvirus,PVX)对转基因烟草的攻毒实验表明,4种突变体均使PVY－C HYC－Prog严重丧失了促进PVX病毒粒子在寄主体内积累和提高PVX致病性的功能,说明CCCT、PTK基序为PVY－C HYC－Pro介导PVX／PVY协生作用所必需。同时证明了HC-Pro具有增强PVX在寄主体内长距离运输的功能。     

番茄环纹斑点病毒与马铃薯Y病毒复合侵染烟草的细胞病理特征

在自然情况下, 番茄环纹斑点病毒(TZSV)和马铃薯Y病毒(PVY)通常复合侵染同一植株。该文首次报道了TZSV和PVY复合侵染烟草(Nicotiana sp.)植株的细胞病理特征, 并与单独侵染进行了比较分析。复合侵染的烟草植株细胞中, TZSV病毒颗粒明显增多, 并聚集于囊膜内形成包涵体, 与PVY的风轮状及片层状内含体和病毒颗粒聚集体交叉分布于细胞质(内含线粒体明显增多)中, 线粒体、叶绿体和细胞核结构较完整; 两种病毒的颗粒、包涵体和内含体数量均较单一侵染增多, 且对寄主亚细胞结构的破坏较单一侵染为轻, TZSV和PVY及其与寄主的互作可能存在协生作用。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…