羧肽酶A的脱毒功能及其应用前景

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由曲霉菌和青霉菌产生的一种真菌毒素,谷物、豆类、葡萄酒和咖啡等制品常常受到其污染,对食品安全构成了极大的威胁。随着全球气候的变化,OTA的污染情况日益严重,为保障人类及畜禽动物的安全,不少研究人员正致力于脱除或降解食品及其原料中的OTA。目前很多真菌和细菌被报道能降解OTA,然而它们产生的降解酶很少被定性和纯化,降解产物也不明确,无法应用于工业中。羧肽酶A(Carboxypeptidase A,CPA)对OTA的脱毒能力已被广泛证明,同时它的性质、结构及作用机理都极为清晰,降解产物也对人体无害,是脱除OTA的理想产品。因此通过基因工程和蛋白质工程大量表达获得稳定并效率高的羧肽酶A是降解OTA的新途径。将从OTA的污染状况及其生物脱毒机制、CPA的脱毒能力、CPA作为脱毒剂的发展前景等方面进行综述,旨在为真菌毒素降解酶制剂的开发和应用奠定理论基础。     

赭曲霉毒素A的产生、毒性机制与生物合成研究进展

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是曲霉属和青霉属等真菌的次生代谢物,广泛污染谷物、葡萄、坚果等农产品和饲料,造成严重的经济损失。此外,OTA的肝肾毒性和三致作用(致畸、致癌、致突变)已经得到越来越多的数据支撑,证实其对人类健康存在巨大威胁。OTA及其衍生物的理化性质已经有较为全面的研究,但是其合成过程及调控机理尚不明确。本文整理了赭曲霉毒素A的理化性质及产毒菌株,总结了OTA污染及致病情况的最新研究进展和各国的限量标准,最后分析了OTA的合成机制,讨论了未来OTA理论及应用层面的研究方向,为赭曲霉毒素A的风险评估提供数据支持,同时为OTA生物合成和调控机制提供理论参考。     

氧脂素对赭曲霉在大豆培养基质中合成赭曲霉毒素A的影响

【背景】赭曲霉毒素A (ochratoxin A,OTA)是曲霉属和青霉属等真菌的次级代谢产物,严重威胁农产品及食品安全,氧脂素羟基十八碳二烯酸(hydroxyoctadecaenoic acids,HODEs)被认为可能是曲霉属的群体感应信号分子,调节曲霉的生长发育和次级代谢物生成。【目的】主要研究HODEs对赭曲霉(Aspergillusochraceus)菌株AS3.4412产生OTA的影响,检测孢子密度、培养基类别以及内、外源HODEs作用下OTA产量的不同变化。【方法】分别在PDB、黄豆和黑豆培养基中进行赭曲霉的培养,采用高效液相色谱-荧光检测法测定OTA含量,采用高效液相色谱-质谱法测定氧脂素含量,根据变化规律寻找赭曲霉群体密度、氧脂素、OTA三者间的关系。【结果】低密度赭曲霉培养物(103 spores/mL)中9(S)-HODE/13(S)-HODE及OTA产量高于高密度赭曲霉(106 spores/mL);外源添加9(S)-HODE能促进OTA合成,13(S)-HODE可以抑制OTA合成;赭曲霉侵染抗氧化能力更高的黑豆产生更多的OTA。【结论】OTA的合成受到赭曲霉群体密度和氧脂素的影响,推测9(S)-HODE和13(S)-HODE是赭曲霉群体感应信号分子,并且二者在调节OTA合成中具有相反的作用。     

甘草药材上的污染真菌类群及其产毒素特性

对药材市场上霉变甘草样品的污染真菌进行分析,共得到4属7种真菌,包括Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Mucor属,其中Penicillium polonicum、Aspergillus parasiticus以及P.crustosum是优势真菌。采用高效液相色谱-质谱联用技术对优势菌菌株产黄曲霉毒素及赭曲霉毒素A的特性进行检测。结果表明A.parasiticus主要产生黄曲霉毒素(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA);而Penicillium polonicum主要产生赭曲霉毒素A(OTA)。     

一株产赭曲霉毒素A黑曲霉的筛选与鉴定

【目的】筛选出可产生赭曲霉毒素A (OTA)的霉菌菌株。【方法】利用CYA和YES培养基从实验室32个霉菌样品中筛选目的菌株。利用高效液相色谱-荧光检测法对OTA产生菌进行初筛,利用高效液相色谱-质谱联用对OTA初筛菌株进行复筛。通过菌落形态、菌丝及分生孢子形态、ITS DNA序列、β-Tubulin基因序列及Calmodulin基因序列分析等鉴定目的菌株。【结果】得到一株OTA产生菌株1062,该菌株能在25 °C条件下,在CYA、YES和CA培养基中很好生长。结合形态学、对培养基的要求以及上述3个基因序列的进化树分析,该菌株属于黑曲霉(Aspergillus niger)。【结论】菌株1062具有OTA产生能力,是一株黑曲霉。     

赭曲霉毒素A降解菌株的筛选及脱毒酰胺水解酶的基因克隆和表达

【背景】赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)是一种可以致癌的真菌毒素,其污染严重影响食品安全,危害人类健康。生物降解法去除OTA污染是近些年的研究热点,发掘高效的OTA降解脱毒酶资源具有重要的意义。【目的】筛选高效的OTA降解菌株并从中克隆降解基因,为生物脱毒方法的开发提供基因和酶资源。【方法】利用OTA为唯一碳源的筛选培养基从土壤中筛选纯化OTA降解菌株,通过16S rRNA基因序列分析确定其分类地位,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分析其降解产物。通过同源序列比对的方法克隆降解基因并与载体pET-29a(+)相连,然后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。利用Ni²⁺亲和层析对表达产物进行纯化,研究其对OTA的降解活性和酶学特征。【结果】筛选到一株高效的OTA降解菌株,在12 h内能够完全降解1 μg/mL的OTA;初步鉴定该菌株属于Niastella,编号为JX-6;菌株JX-6通过酰胺键断裂途径降解OTA生成无毒的OTα;从菌株JX-6中鉴定了一个OTA酰胺水解酶,命名为NcOTase;NcOTase与已报道的OTA酰胺水解酶序列相似性较低,仅为31%–53%;纯化的NcOTase具有OTA水解活性,比酶活为60.3 U/mg,活性显著高于大部分已报道的OTA降解酶。【结论】NcOTase是一个高效的OTA降解脱毒酶,在去除食品和饲料中OTA污染方面具有很好的应用前景。     

曲霉属三新记录种(英文)

报道了曲霉属的3个中国新记录种:Aspergillus dimorphicus,A.fumigatiaffinis以及A.westerdijkiae。比较了其与相近种的形态及分子序列β‐tubulin基因的差异,并采用高效液相色谱‐质谱联用技术对菌株产赭曲霉毒素A(OTA)的能力进行了测定。检测结果表明Aspergillus westerdijkiae CGMCC3.15268在大米培养基上能够产生OTA,单位菌丝的产毒量为17.26μg/kg;而A.fumigatiaffinis CGMCC3.15275以及A.dimorphicus CGMCC3.17045未检出OTA。     

水稻秸秆还田时间对土壤真菌群落结构的影响

为揭示水稻秸秆还田对土壤真菌群落结构的长期影响,采用荧光定量PCR和PCR-DGGE技术分析了秸秆还田90,180,270 d和360 d的土壤真菌基因丰度和群落结构组成演变趋势,并利用冗余分析(RDA)研究土壤真菌群落结构变化与环境因子的关系。结果表明:随着秸秆还田时间的增加,土壤真菌群体数量和多样性指数(H、R和E)显著增加,在360 d时达到最高。对DGGE图谱的特征条带进行胶回收、测序,系统进化分析表明,土壤真菌主要种群包括:接合菌(Zygomycete sp.)、盐腐霉菌(Pythium salinum)、肉盘菌(Uncultured Sarcosomataceae)、牛粪盘菌(Ascobolus stercorarius)、大链壶菌(Lagenidium giganteum)、青霉菌(Penicillium sp.)、曲霉属真菌(Aspergillus sp.)和疏绵状丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、灰绿曲霉菌(Aspergillus glaucus)、禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)和枝顶孢霉菌(Acremonium sp.),其中青霉菌(Penicillium sp.)、曲霉属真菌(Aspergillus sp.)和枝顶孢霉菌(Acremonium sp.)具有纤维素降解能力,而枝顶孢霉菌(Acremonium sp.)在90 d时成为新的优势菌群。RDA分析表明,90 d和180 d秸秆还田与对照土壤的真菌群落结构较为类似,270 d和360 d的秸秆还田与对照土壤的真菌群落结构发生了明显变化。土壤有机碳、pH和速效磷是引起土壤真菌群落结构及多样性变异的主要因素。     

一株产赭曲霉毒素A黑曲霉及其产毒条件

以甘肃河西走廊葡萄酒产区分离的曲霉属黑色组H1菌株为试验材料,依据形态特征和基于rDNA ITS、β-tubulin及calmodulin基因序列的系统发育分析,将其鉴定为黑曲霉Aspergillus niger。利用HPLC-FLD和UPLC-MS/MS检测分析确认H1菌株具有产生赭曲霉毒素A(OTA)的能力。进一步研究了培养条件对H1菌株产毒的影响。试验结果表明,YES培养基比CYA培养基更利于H1菌株的营养生长和产OTA;18–25℃,该菌生长较慢,但OTA产量高;18℃H1菌株在YES培养基上培养9d时OTA的产量达到最大值,为26.01μg/g YES;30–37℃该菌的生长速率显著提高,但OTA产量很低,甚至不产OTA。试验结果表明,温度和营养条件是影响H1菌株产生OTA能力的重要因素。     

杂色曲霉素的制备及其在稻米中含量的测定

杂色曲霉素是致肝癌的霉菌毒素,能产生它的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、构巢曲霉(A.nidulans)等是粮食上常见的霉菌。因此,对粮食中杂色曲霉素的测定对保健事业有重要意义。我们制备了杂色曲霉素标准品并研究了稻米中杂色曲霉素的测定方法。现将方法介绍如下。     

基于纳米颗粒的赭曲霉毒素A高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍。OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁。本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA)。在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3%和8.1%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应。玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6%-115.7%,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好。本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景。     

玉米中赭曲霉毒素A的辐照降解及辐解产物的毒性评价

目的：评价γ射线对赭曲霉毒素A降解的影响和辐射分解产物的特性。方法：对甲醇水溶液中的赭曲霉毒素A（OTA）进行60Coγ-射线辐照处理。结果：γ射线能有效地降解水溶液中的OTA，并可以检测出4种主要的辐解产物。在4 kGy的辐照剂量下，OTA（200 ng/mL）的辐照降解效率可达90%。一种辐解产物毒性低于OTA，其余产物均无毒性记录。 OTA可影响小鼠的生长状态，如体重增加和食物利用率，OTA的辐射降解产物大多不产生影响。本研究中，OTA可破坏小鼠血小板和淋巴细胞，增加小鼠血清AST、GLU、BUN，降低LDH。小鼠的某些内脏可被OTA破坏，如肝、肾、肺等，但OTA辐解产物对所有脏器均无影响。结论：OTA对小鼠有毒性作用，OTA降解的辐解产物无明显毒性作用。     

黑曲霉中生物合成赭曲霉毒素A的非核糖体肽合成酶基因的鉴定

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是国际癌症研究机构认定的"2B"类致癌物。黑曲霉Aspergillus niger是美国食品药品监督局认可的食品安全菌。然而近年来陆续发现某些黑曲霉菌株能够产生OTA,这会对人类健康构成潜在威胁。阐明黑曲霉生物合成OTA的关键基因有助于理解OTA生物合成机制,这对OTA污染的防控具有重要意义。本研究克隆了产OTA黑曲霉中非核糖体肽合成酶(NRPS)编码基因(An15g07910),并对其进行了生物信息学分析,在此基础上采用同源重组的方法敲除了该基因,获得了一株性能稳定的敲除突变株Δnrps。与野生株相比,Δnrps突变株的表型在CYA培养基中并无明显改变,但在7d培养期间完全失去了合成赭曲霉毒素α(ochratoxinα,OTα)和OTA的能力,而赭曲霉毒素β(ochratoxinβ,OTβ)的合成不受影响。在野生株培养过程中,该nrps基因前4d表达量逐渐增大,并在第4天达到最高,随后基因表达量逐渐下降并趋于稳定,这与OTA的含量变化基本一致。结果表明该nrps基因(An15g07910)参与OTA的生物合成,其编码的NRPS可能负责催化苯丙氨酸部分和二氢异香豆素部分的交联。     

产赭曲霉毒素A黑曲霉的PCR法检测

【目的】快速检测产赭曲霉毒素A(OTA)的黑曲霉。【方法】根据黑曲霉(Aspergillus niger)CBS513.88中An15g07920基因编码聚酮合酶的酰基转移酶(AT)域设计引物,建立针对产OTA黑曲霉的聚合酶链式反应(PCR)检测方法。【结果】对72株曲霉属菌株(黑曲霉、炭黑曲霉、赭曲霉、佩特曲霉、寄生曲霉和塔宾曲霉)进行检测,发现产OTA的黑曲霉能够扩增出特异性条带,而产OTA的其它菌株不能扩增出条带;检测出3株假阳性的产OTA黑曲霉,实时定量PCR分析此3株菌中An15g07920的同源基因表达情况,发现在产毒条件下可正常表达,排除了因基因无法表达导致假阳性的可能。本方法的检测灵敏度为25 pg的DNA含量,在污染所试农产品孢子浓度大于4.0×10~4–4.0×10~5个/g时可有效检测出产毒菌株。【结论】本方法虽会产生4%的假阳性结果,但是仍可作为产毒黑曲霉有效的快速检测方法,并在农产品污染产毒黑曲霉时进行有效预警。     

海鞘真菌的形态鉴定及其代谢产物抗菌活性研究

为寻找产生新颖抗菌活性物质的海洋真菌,以海鞘为原料,采用平板涂布法分离出14株真菌,并对其进行形态学鉴定和抗菌活性的初筛。结果显示:从海鞘中共分离出14株真菌,根据形态观察初步鉴定其分属青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、枝孢属(Cladosporium sp.)、麦轴梗霉属(Tritirachium sp.)等4个属。14株菌中有抗菌活性的共11株,优选出抗菌活性较强抗菌谱较广的4株菌分别是Asc-2-4(青霉属)、Asc-2-12(青霉属)、Asc-1-1(青霉属)和Asc-2-1(曲霉属)。青霉属菌株Asc-2-12的抑菌活性最明显,抑菌圈直径最大达到21.91 mm。海鞘共附生真菌是寻找抗菌物质的一个资源,其中的3株青霉属和1株曲霉属的抗菌活性有深入研究的价值。     

基于碳点的新型无淬灭剂荧光适配体传感器检测赭曲霉毒素A（英文）

赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)是食品中常见致癌性生物毒素，对人类和动物的健康造成威胁。基于新型的荧光硫和氮掺杂的碳点(S-N-CDs),并用特异性识别OTA的适配体修饰，建立了一种用于检测赭曲霉毒素的无淬灭剂的适配体传感器。S-N-CDs通过L-半胱氨酸的水热处理合成。当OTA存在于传感系统中时，CDs对OTA有敏化作用，并形成一个更大的共轭系统，导致荧光增强。通过计算传感器的荧光值变化，可得到传感系统中OTA的浓度。这种高灵敏度的基于荧光的检测方法的检测限为4 ng/mL,线性反应范围为4～1 000 ng/mL,在特异性分析中P<0.01,具有良好的特异性，可用于红酒样品的检测，回收率在80%～96%之间。这项研究成功地开发了一种新型适配体传感器，为快速检测OTA提供了一种有效的方法，也为检测各种生物分析物提供了一种可靠的基于适配体的技术。     

茯砖茶中优势菌种的鉴定

所谓“黄霉菌”是茯砖茶发酵中的益菌。它实际上是散囊菌属产生的黄色闭囊壳。优势种经鉴定为冠突散囊菌[Eurotium cristatum(Raper ＆ Fennell)Malloch & cain],它的无性型是针刺曲霉(Aspergillus spiculosus Blaser),异名是冠突曲霉(A.cristatus Raper &Fennell)。文中还对有关该菌的命名问题和在我国的分布作了讨论。     

连作花生田根际土壤优势微生物的分离和鉴定

【目的】从不同连作年限的花生田根际土壤中分离优势微生物并进行鉴定,为研究花生连作后优势微生物的变化奠定基础。【方法】采用土壤稀释分离法从不同连作年限花生根际土壤中分离优势细菌、真菌和放线菌,结合菌株形态特征、培养性状、生理生化特征及16S rDNA序列分析对细菌、放线菌进行鉴定,通过形态特征、培养特征和分子鉴定方法对优势真菌进行鉴定。【结果】从连作花生田根际土壤中分离鉴定出7种优势细菌、7种优势真菌和7种优势放线菌。7种优势细菌分别为Leifsonia xyli、氯酚节杆菌(Arthrobacterchlorophenolicus)、黄色微杆菌(Microbacterium flavescens)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、巴斯德菌属(Pasteurella sp.)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。7种优势真菌分别为枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉有性型(Hypocrea lixii)、Exophiala pisciphila、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、曲霉(Aspergillus sp.)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。7种优势放线菌分别为紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、华丽黄链霉菌(Streptomyces flaveus)、Streptomyces panaciterrae、不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、假浅灰链霉菌(Streptomyces pseudogriseolus)、纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)和金色链霉菌(Streptomyces aureus)。【结论】本研究是第一次系统的从连作花生根际土中分离鉴定优势微生物,种植花生后根际土壤中优势微生物的种类发生了明显变化,但变化没有规律。     

食品中桔霉素控制方法的研究进展

桔霉素(Citrinin,CIT)是由青霉、曲霉和红曲霉属产生的一种具有肾毒性的真菌毒素。许多食品和饲料中均含有桔霉素,污染范围十分庞大。桔霉素可与其他真菌毒素发生协同作用,如展青霉素(Patulin,PAT)、赭曲霉毒素(Ochratoxin,OTA)等,从而增强其毒性作用,对人及动物健康造成更大的危害。现阶段常用的控制手段主要有物理、化学和生物方法,均取得了一定的成就。本文简单介绍了桔霉素的毒性及污染状况,对桔霉素控制方法的研究进展进行了综述。     

曲霉属黄绿组的一个产毒新种

本文报道曲霉属黄绿组(通常称黄曲霉群)的一个产毒新种肇庆曲霉(Aspergillus zhaoqingensis sp.nov.)。该菌分离广东肇庆土壤,在形态上近于米曲霉(A.oryzae),但作为该组的关键分类特征分生孢子纹饰很不相同:本种的分生孢子明显的粗疏粗糙至具不规则的脊状突起而米曲霉则为光滑或稍粗糙。本种能产生黄曲霉毒素B_1而米曲霉则不产生。本菌亦不同于组内其它菌种。文中对与黄曲霉密切相关诸种也作了简短的讨论。