盐藻基因组DNA文库的构建(英文)

以ＬａｍｂｄａＦＩＸ○ＲⅡ为载体,构建了盐藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓａｌｉｎａ）的基因组文库。该文库包含了１．１×１０６个重组子,插入片段平均大小为１８ｋｂ左右,含插入片段的频率为１００％。该文库的容量约为盐藻单倍体基因组的２００倍。     

基于微量DNA样本的简化甲基化文库构建方法研究

RRBS(简化甲基化测序)是一种有效研究DNA甲基化状态的测序方案。文库构建是该方案中最关键的实验步骤之一,RRBS文库构建往往因为酶切产物少,文库构建步骤繁多等因素,导致DNA起始量需要1 ug以上。然而很多来源于人的样本,如冰冻组织穿刺、石蜡切片、显微微切割等,都往往只能获得100 ng以下的DNA,无法满足常规RRBS文库构建的起始DNA总量要求,从而大大限制RRBS技术的应用范围。本研究主要探讨并设计了基于微量DNA样本(100 ng)的RRBS文库构建策略,主要通过优化Msp I酶切条件、DNA片段大小筛选、缩减反应步骤及减少DNA转移次数等技术手段,大大提高了DNA回收率,进而建立了2种有效使用微量DNA样品的RRBS文库构建方案(即EA-Method和WB-Method方案)。EA-Method方案在处理100 ng左右的DNA时,有经济、快速、高效的特点,但文库质量略差于WB-Method方案;WB-Method方案可将DNA起始量降低至10 ng,并且文库质量高。为验证WB-Method方法的可靠性,研究人员选取了3种志愿者样本(全血和口拭子),采用WB-Method同时进行常量和微量RRBS文库构建,并进行Illumina Hiseq平台测序,数据通过生物信息分析得到微量RRBS检测的CpG,CHG,CHH中C碱基的甲基化比例与常量RRBS结果一致。同时,该方法可以大大降低DNA损耗及损伤,因而该方法可将RRBS技术应用到更广泛的样本类型中去,有效拓展RRBS的研究领域。     

可转化人工染色体(TAC)文库载体DNA的制备

对可转化人工染色体(TAC)pYLTAC747NH/sacB文库载体DNA的制备条件进行了较系统的模索和研究.结果表明,该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA.对其闭环载体DNA分别用不同酶量的Hinid Ⅲ酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳Hind Ⅲ完全酶切条件为2 U Hind Ⅲ/μg闭环载体DNA、37℃酶切30 min;分别用0.5 MBU和1 MBU HK脱磷酶/μg对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为1 MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1 h;将所制备的线性载体DNA与λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段进行连接,连接产物转化频率较高,其电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞频率可达到9.6×10s.     

构建丝状真菌大片段基因组文库载体DNA的制备

载体DNA的制备是构建大片段基因组文库的关键步骤之一,高质量载体DNA受到酶切、脱磷等因素的影响,以载体pBHYG为材料,优化了限制性内切酶胁HindⅢ酶切和小牛肠碱性磷酸酶(CLAP)脱磷的作用条件,并在T4连接酶作用下自连,通过胶回收纯化制备了可用于进一步构建大片段基因组文库的线性载体DNA。     

橡胶树甲基化过滤文库的构建

为高通量富集橡胶树基因编码序列,文章首次利用大肠杆菌McrBC限制修饰系统构建了巴西橡胶树基因组甲基化过滤文库.该文库未扩增和扩增后的滴度分别为2.6×106pfu/mL和9×109pfu/mL,阳性克隆率为86.4%,插入片段大小为1～2.5 kb,平均长度为1.2 kb.随机挑选100个克隆进行测序,共拼接出81个非冗余序列,其中包括6个重叠群(Contigs)和75个单一序列(Singlets),冗余度为17.35%.Blast分析发现,39.5%非冗余序列与Nr库中功能基因同源,14.81%与EST数据库中序列同源,32.1%序列为未知序列,且部分序列为开花调控、抗虫和抗病等功能相关的同源基因.橡胶树甲基化文库的建立为橡胶树重要功能基因发现和克隆提供一条重要途径.     

癌症DNA甲基化调控位点的识别

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在基因的转录调控方面具有重要的作用。异常的DNA甲基化可以导致癌症等复杂疾病发生,癌基因相关的DNA甲基化调控位点的识别对于解析癌症的发生发展机制及识别新的癌症标记具有重要意义。本研究通过整合The Cancer Genome Atlas(TCGA)的泛癌症基因组的高通量甲基化谱和基因表达谱,识别癌基因相关的DNA甲基化调控位点。对于每种癌症分批次计算Cp G位点甲基化与相关基因表达之间的相关性,并筛选调控下游基因的Cp G位点(包括强调控位点、弱调控位点和不调控位点),结果表明仅有一半的Cp G位点对下游基因具有调控作用;对癌症间共享的调控位点的分析发现不同癌症间共享的调控位点不尽相同,表明癌症特异的甲基化调控位点的存在。进一步地,对差异甲基化和差异表达基因的功能富集分析揭示了受甲基化调控的基因确实参与了癌症发生发展相关的功能。本研究的结果是对当前甲基化调控位点集的重要补充,也是识别癌症新型分子标记特征的重要资源。     

关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

细菌人工染色体（BAC）文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAG文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备,制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切,脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,并结合凝胶回收缩化技术,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关系步骤。     

片段富集后以质粒为载体直接克隆构建文库

最近,我们叙述了应用较小的然而却是有代表性的质粒构建文库技术,对特异性基因组DNA进行克隆的一种简便而快速的实验方法(1)。这一方法是用多种限制性内切酶对基因组DNA进行消化,用Southern吸印分析方法鉴定出所需要的片段,然后用琼脂糖凝胶电泳(?)定分子大小。     

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。     

兔(AG)n微卫星DNA富集文库的构建与鉴定

目的:微卫星遗传标记具有数量大、分布广且多态信息含量高等优点,因而被广泛用于动植物遗传图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择及亲缘关系鉴定等领域。方法:采用亲和捕捉法。结果:构建了兔(AG)n微卫星DNA序列的富集文库,文库含重组克隆4 850个,其中含有(AG)n微卫星DNA序列的阳性克隆占66.7%。     

DNA甲基化与克隆动物的发育异常

通过核移植技术得到的大多数克隆动物在出生前就已经死亡, 只有极少数可以发育至妊娠期末或者存活至成年, 即使是存活下来的克隆动物也伴有不同程度的发育缺陷和表型异常。DNA甲基化是支配基因正常表达的一种重要的表观遗传修饰方式, 是调节基因组功能的重要手段, 在胚胎的正常发育过程中具有显著作用。通过对DNA甲基化模式的研究, 人们发现克隆动物中存在着异常的DNA甲基化状态, 而这些异常的DNA甲基化模式可能就是导致克隆胚早期死亡以及克隆动物发育畸形的主要原因。文章主要论述了DNA甲基化的作用, 克隆动物中异常的DNA甲基化模式, 以及造成克隆胚胎甲基化异常的原因等问题。     

蜘蛛基因组DNA Cosmid文库构建和拖丝蛋白基因的克隆

The genomic DNA Cosmid library was constructed from Nephila clavipes spider muscle using SuperCos 1 Cosmid as a vector.The title of library was >5×10 4 cfu/μg ligated DNA.On the basis of published sequence from a partial cDNA sequence of the 3′end of the dragline silk gene, we designed and synthesized 3 oligonucleotides.Oligonucleotides were labeled with non radioactive digoxigenin dUTP and detected with chemilluminescent substrate.56 positive recombinants were screen from the Cosmid library using DIG Oligo 2 as a probe.DNA dot hybridization using DIG Oligo 1 and DIG Oligo 3 as the probes, respectively, 3 positive signals were identified from 56 colonies.They were appeared the same pattern when DNA from the colones digested by restriction enzymes.The spider dragline silk gene was confirmed again by Southern blot hybridization.     

用单链噬菌体载体克隆DNA

丝状单链DNA大肠杆菌型噬菌体M 13、fd及f1,近来被作为一类新的DNA克隆载体而发展起来了,它的优点显著超过其它载体,包括其它两类大肠杆菌寄主的克隆载体:质粒和噬菌体λ。本综述描述单链噬菌体载体的生物学及应用方法以及测量插入DNA大小和排列方向的快速方法,特别是单链载体对DNA定序和离体位点定向诱变     

人脑胶质瘤c DNA文库的构建

<正> 本室曾制备得到两株单克隆抗体,分别特异地针对两种胶质瘤相关抗原-47kD和180kD的膜糖蛋白。为了阐明这两种胶质瘤相关抗原的生物化学本质及其在正常胶质细胞向恶性转化过程中可能起的作用,我们构建了一个λgtll表达型的人脑胶质瘤cDNA文库,以便用上述单克隆抗体作为探针,从该文库中筛选出与之对应的胶质瘤相关抗原的cDNA克隆。现将建库工作简述于下。     

DNA克隆载体的发展和应用

ＤＮＡ克隆载体的发展和应用刘建喜林爱星丁翔陈永福（中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京１０００９４）ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓＬｉｕＪｉａｎｘｉＬｉｎＡｉｘｉｎＤｉｎｇＸｉａ...     

位点特异DNA甲基化调控细胞周期素D1基因

DNA甲基化是基因表达调控的重要方式,一般被认为以CpG岛形式发挥作用;近年的研究表明,位点特异的DNA甲基化以元件(cis-regulatory element)的形式在生物微进化以及基因精细调控中发挥重要作用。我们的研究结果显示,曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)导致细胞周期蛋白D1基因表达下调,以及其核心启动子的+65到+77之间的两段串联CpG序列发生DNA甲基化。报告基因结果显示,由细胞周期素D1核心启动子片段驱动的报告基因活性在TSA处理后下降到原来0.12,而前段(A)突变与后段(B)突变时,报告基因活性分别下降到原来1/7.6与1/8.36,双突变则下降到原来1/7.51。对于CMV启动子嵌合15 bp片段驱动的报告基因活性,野生型、A、B与AB双突变型报告基因活性分别下降1/1.48、1/1.17、1/1.51以及1/1.21。体外甲基化研究结果显示,与对照组相比,M.SssⅠ处理组的启动子活性中,野生型活性下降到原来1/8 800,A突变型活性下降到原来1/2 700,B突变型活性下降到原来1/4 156,双突变型活性下降到原来1/6 222。应...     

染色体特异DNA文库的构建与鉴定

为构建人类21号染色体特异DNA文库, 以应用于人类遗传疾病的鉴定和研究, 文章采用循环温度梯度法溶解释放微分离的人外周血细胞21号染色体DNA, 将其进行简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligo nucleotide primer-PCR, DOP-PCR)扩增后, 利用100~500 bp和500~2 000 bp分段回收纯化的两种不同片段大小的DOP-PCR产物构建染色体特异DNA文库, 并分别采用荧光原位杂交(Florescence in situ hybridization, FISH)和斑点杂交对DOP-PCR产物的来源和随机取样的文库克隆进行检测以评估所构建DNA文库的特异性。结果表明: 循环温度梯度法能有效溶解释放微分离的21号染色体DNA; 通过对DOP-PCR产物的分段回收纯化和克隆, 增加了大片段DNA的连接效率; 利用FISH技术和斑点杂交双重鉴定实验证明了文库的特异性, 从而构建了21号染色体特异的DNA文库, 并建立了构建染色体特异DNA文库及检测其特异性的方法, 为21号染色相关遗传疾病的鉴定和研究奠定了基础。     

刺鳅X染色体DNA文库的构建

刺鳅（Mastacembelus aculeatus）是具有明显X和Y异形性染色体分化的淡水鱼。本实验室通过显微切割（Microdissection）和兼并引物PCR（DOP-PCR）方法,从雌性刺鳅中期染色体分裂相中分离获得X染色体并扩增其DNA,利用T载体和电转化方法,建立了刺鳅X染色体DNA质粒文库。该文库插入片段的平均长度约为500bp,理论上包含X染色体98％以上的序列。当用荧光原位杂交（FISH）来验证文库的专一性时发现,在无竞争性DNA杂交条件下,整个X和Y染色体上都表现出强烈的杂交信号,并且常染色体上也出现一些随机散布信号;当含有竞争性DNA时,常染色体上的信号消失,仅性染色体上异染色质区域保留有较强信号。就此,本文对刺鳅性染色体上的序列类型进行了探讨。