广州市两株人感染H5N6禽流感病毒全基因组序列特征分析

H5N6禽流感是重要的人兽共患病,给公共卫生带来严重威胁。为研究人感染H5N6禽流感病毒的基因特征,本文对广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进行全基因组序列扩增,应用生物信息学软件分析分子变异和遗传进化特征。结果显示:两毒株各基因片段同源性存在差异,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因同源性最高为98.3%,PB2基因同源性最低为85.2%。A/Guangzhou/41641/2014(H5N6)病毒的HA、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)基因与猫源毒株A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)亲缘关系较近,推测可能起源于共同祖先。两株病毒均为禽源高致病性病毒,HA和NA表面蛋白受体结合位点、裂解位点和耐药位点未发生变异。内部基因重要位点均有不同程度的变异,其中以41641病毒变异较大,并发生PB2蛋白E627K突变。两株病毒均发生与不同亚型病毒之间的重组现象,41641病毒的内部基因分别与H5和H9N2/H7N9发生重组,其中PB2和PB1基因分别与2013年暴发的华南分支和华东分支H7N9禽流感病毒亲缘关系相近,A/Guangzhou/37845/2015(H5N6)病毒的内部基因与H5N1/H5N6病毒发生重组。因此,广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进化起源不同,属于两种不同的基因型,本研究推测2013年暴发的H7N9禽流感病毒在新型H5N6重组病毒的进化过程中起到重要作用。     

禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制

禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁。本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性。结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织;免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞;免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染II型肺泡细胞。结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能。     

甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为研制新型H7N9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒,根据GenBank中公布的新型H7N9亚型(2013年)禽流感病毒血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒方法。实验结果表明,该方法灵敏度高、特异性好,能够检测到最低浓度为10拷贝/μL数量级的阳性标准品,不但能够将禽流感病毒H7亚型与H1、H3、H5、H6和H9亚型区分开,而且可将新型N9亚型禽流感病毒与原有的N9亚型区分开。采用该方法对珠海市2 700份样品的检测结果与预期结果一致,证实该方法具有较好的推广应用前景。     

苏州活禽市场禽流感病毒(H7N9)季节变化及HA、NA、PB2基因系统进化分析

自2013年3月中国首次发现新型禽流感病毒H7N9以来,其于2013-2014年期间发生流行,2015年也有散发性感染。该病毒的流行不仅危及家禽养殖业,还对公共卫生安全造成严重威胁。为调查活禽市场中H7N9的进化史和季节性变化,本研究于2013年7-12月在H7N9主要流行地区之一江苏省苏州市活禽市场采集2 655份鸡、鸭咽拭子样本,对样本中流感病毒核酸进行检测。结果显示,冬季样本中H7N9阳性率显著高于夏季样本,同时发现样本中存在H5、H7和H9亚型毒株之间的混合感染。进一步对H7N9阳性样本的HA、NA和PB2基因序列进行分析,结果表明阳性样本中HA、NA和PB2基因序列与新型H7N9病毒的相应基因序列同源,其在家禽体内传代时也在继续进化。特别是一些样品中PB2基因序列与H5N1病毒PB2基因序列的同源性较高。结果提示,苏州存在一种新型H7N9病毒基因重排的可能性,建议在活禽市场对所有禽流感病毒亚型进行持续监控,从而有助于流感病毒的及时防控。     

H7亚型禽流感病毒与禽类和人类的关系

2013年在中国首次发生了H7N9亚型流感病毒感染人事件,已经证实H7N9型禽流感是一种新型禽流感,是全球首次发现感染人类的新亚型流感病毒,以往这种病毒只在野生鸟类存在和传播。H7N9型禽流感病毒属于H7亚型中的一种,全球感染人的H7亚型病毒主要分为两大支系,即北美支系和欧亚支系,感染人的流感亚型也主要集中在H7N7,H7N3,H7N2等亚型上。为了清晰的了解H7亚型病毒的来龙去脉,本文重点讨论了A亚型流感病毒的宿主分布、H7亚型病毒感染禽类和人类的历史、H7亚型病毒的生物学特性以及未来研究展望。     

水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析

采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。     

华东地区家鸭中N1亚型禽流感病毒NA基因的遗传进化分析

为了解华东地区家鸭内禽流感病毒的遗传进化情况,对2002~2006年分离自华东地区家鸭的3种主要N1亚型的禽流感病毒:2株H1N1、10株H3N1和14株H5N1,共26株病毒的NA基因进行了遗传进化分析。结果表明,华东地区家鸭中的N1亚型的禽流感病毒正处于不断进化状态中。14株H5N1禽流感病毒均在NA的茎部缺失20个氨基酸(49~68位),而其他N1亚型的禽流感病毒的NA都未见发生此缺失。H3N1病毒可能与H1N1病毒发生了NA基因的重排,但是目前还没有直接证据表明华东地区家鸭中H5N1禽流感参与了基因重排。     

我国部分禽流感病毒H5N1之HA序列变异演化分析

从GenBank上获得我国人(Homo sapiens)、家禽和野鸟42株H5N1亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列,利用DNAStar分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA基因核苷酸序列同源性,构建遗传进化树.探讨我国部分人、家禽和野鸟H5N1病毒基因的遗传进化关系.序列分析结果表明:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因持续地发生着变异,但并非以均一速度进行,时间间隔愈长,核苷酸同源性愈低;我国同一地区或临近地区,当年或前后两年发生的人及家禽感染的禽流感病毒高度同源.推测我国部分人发生的禽流感可能是通过家禽感染的;候鸟的迁徙在传播病毒过程中所起的作用有待深入探讨.     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

1株含H9N2内部基因的H5N1亚型基因重配禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

在对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况的流行病学监测过程中,从表观健康家鸭体内分离到一株H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/009/2008(简称Dk/SD/009/08)。为了解该毒株的基因组构成,对该分离株进行全基因测序。测序结果显示:该毒株HA裂解位点处的氨基酸序列为PLRERRRK-R/GL,符合高致病性禽流感病毒的分子特征,且参照H5N1国际统一命名准则,Dk/SD/009/08的HA基因属于2.3.4进化支。BLAST结果显示,HA、NA、NP及NS基因均与H5N1亚型病毒的核苷酸一致性最高,而RNA聚合酶基因(PB2、PB1、PA)及M基因则与H9N2亚型病毒的亲缘关系最近,故推测该分离株可能是一株天然重组病毒;遗传进化分析进一步表明,流行于华南地区鹌鹑中的G1-like H9N2亚型病毒可能为该分离株提供部分的内部基因。     

1例重症肺炎可疑H7N9禽流感的护理

H7N9 禽流感是由新亚型 H7N9禽流感病毒引起,该病毒是全球首次发现,因其是一种新亚型,起病急、进展快、致死率高,受到广泛关注[1].我科2013年4月2日收治1例重症肺炎可疑H7N9禽流感的患者,经采取积极的治疗和护理,患者痊愈出院,现将护理体会报告如下.     

人禽流感H7N9、H5N1、H10N8临床特征

人禽流感(human-avian influenza)是一种由禽流感病毒中某些亚型感染人所引起的急性呼吸道传染病,目前能够感染人的禽流感病毒主要有H5、H7、H9和H10亚型。人感染禽流感病毒A(H5N1)、A(H7N9)、A(H10N8)与重症季节性流感临床表现相似,主要表现为重症肺炎,病死率高。人禽流感与重症季节性流感和重症新甲型H1N1流感患者有相同的危险因素,如高龄、合并基础疾病等,但人禽流感临床表现更重。     

我国H9N2亚型禽流感病毒的流行和进化特点

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)于1966年从北美的火鸡群中首次被分离以来。自20世纪90年代以来,H9N2病毒已经在世界多个国家和地区发展成地方流行并形成了稳定的种系,是当前禽流感流行的主要亚型之一,严重危害养禽业的发展。此外,H9N2亚型AIV也可以感染猪,甚至能够直接感染人,具有重要的公共卫生意义。H9N2亚型AIV还可以为H5N1、H7N9以及H10N8等能够直接感染人并致死的AIV提供部分甚至整套内部基因,潜在危害备受关注。对H9N2亚型AIV在我国的流行和进化特点进行了简要综述。     

H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估方面取得新进展

<正>继2013年先后在H5N1和H7N9禽流感病毒跨种间传播研究上取得重大进展后,中国科学院微生物研究所高福课题组在H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估上取得新的突破,研究结果已经于2015年1月9日被国际著名杂志《自然通信》(Nature Communications)在线发表。自从2013年2月我国报道首例人感染H7N9禽流感病毒后,我国已经发生多起人感染H7N9禽流感病毒病例。受体结合实验表明,H7N9病毒的主要流行株系安徽株(A/Anhui/1/2013)具有双受体结合特性,既能结     

流感病毒基因的密码子偏好性及聚类分析

流行性感冒病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒,它造成急性上呼吸道感染,并由空气迅速传播,在世界各地常有周期性的大流行。根据该病毒的基因组CDS序列,探讨了基因组序列密码子的使用模式和特性,并进行了病毒间的聚类分析。结果表明:流感病毒的G+C含量均低于A+U含量,偏向使用以A、U结尾的密码子的程度比使用以G、C结尾的较高,CUG、UCA、AGU、AGC、AGA、AGG、GUG、CCA、ACA、GGA、GCA、AUU、UGA、CAU、CAA、AAU、AAA、GAA等18个密码子为流感病毒共有的偏好性密码子,且以A结尾的居多,尤其偏爱AGA、GGA。聚类结果表明首先亚洲流感病毒H2N2和香港流感病毒H2N2聚为一类,亚洲流感病毒H1N1和俄罗斯流感病毒H1N1聚为一类,1997年和2003年~2004年发生的人禽流感聚为一类,说明它们的密码子使用的偏好性相似;而2009年爆发的甲型H1N1流感和任何一个流感的距离都比较远,说明甲型H1N1流感病毒是一种新型的病毒,不同于以往任何一种流感病毒。     

人感染H7亚型禽流感事件

本研究综述了自1959年以来国内外发生的人感染H7亚型禽流感事件。大多数是在家禽爆发禽流感期间,农场工人在处置感染鸡群过程中被暴露而感染;也有曾接触活禽或曾到过活禽市场而感染;有经禽流感病毒致病的哺乳动物（海豹）感染于人或实验室感染（事故）所致。引起人感染的H7亚型中已知有H7N2、H7N3、H7N7以及2013年在中国发现的新的致病亚型H7N9。H7N2、H7N3、H7N7感染以结膜炎为主,大多为轻症;而H7N9感染以严重的呼吸道感染为特征,表现为重症肺炎,呼吸窘迫综合症,病死率高达33.6%。     

高致病性A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立

建立以Sanger测序方法为基础的新型A(H5N6)亚型禽流感病毒全基因组扩增方法。从GenBank和Global Initiative on Sharing All Influenza Data(GISAID)下载近五年H5亚型流感病毒的HA基因序列,N6亚型流感病毒的NA基因序列,以及H5N1和H9N2亚型流感病毒内部6个基因序列,每个基因序列分别进行比对,在相对保守区域设计用于分段扩增的引物,共32对,选用3株病例分离病毒及6株环境分离病毒对引物进行验证。优化后的32对引物能够有效地扩增9株H5N6亚型禽流感病毒,其中3株病例分离病毒的扩增产物条带单一,无非特异扩增。6株环境标本分离病毒扩增产物中,个别反应有非特异扩增产物。建立了一种能够获得高致病性H5N6亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,该方法简单、快速,为新型H5N6亚型禽流感病毒的进化分析提供了基础。