PFOS对再生东亚三角涡虫抗氧化酶活性的影响

为了探究全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate,PFOS)对再生涡虫抗氧化酶活性的影响,以再生中的涡虫作为实验材料,采用酶活性的测定的方法来探究PFOS对再生中东亚三角涡虫中抗氧化酶活性的影响。结果表明,PFOS刺激涡虫产生应激反应。在再生早期,PFOS胁迫会造成涡虫的氧化损伤和脂质的过氧化,并表现出随着PFOS浓度的升高,涡虫氧化损伤程度加剧的趋势;再生5 d时,机体产生抗氧化的反应来消除体内的氧自由基;在再生的后期,由于涡虫对药物的耐受作用,涡虫的抗氧化反应不显著。     

日本三角涡虫hsp70 cDNA克隆及原核表达

热休克蛋白70 是热休克蛋白家族中的重要成员, 它在保护生物体免受各种胁迫中发挥重要作用。由于其惊人的再生能力, 淡水涡虫作为研究再生和发育的模式动物受到研究者关注。但是, 有关涡虫抗逆性的分子机制却少有报道。研究采用 RACE (Rapid amplification of cDNA end) 技术首次从日本三角涡虫中克隆出hsp70 (Djhsp70)全长cDNA 序列。Djhsp70 cDNA 全长2066 bp, 含有1947 bp 的开放阅读框, 编码648 个氨基酸, 分子量71.18 kD, GenBank 登录号EU380241。DjHSP70 的氨基酸含有真核生物HSP70 家族蛋白的三个标签序列(9–16 位的IDLGTTYS、199—206 位的 DLGGGTFD、334–339 位的IVLVGG)和末端高度保守序列EEVD。经BLAST 检索分析, Djhsp70 的核苷酸序列和推定的氨基酸序列与目前已知HSP70 家族成员高度同源。有趣的是, HSP70 亲缘关系分析表明: 涡虫更靠近脊椎动物, 而与无脊椎动物果蝇和线虫相距较远。为了制备抗体研究DjHSP70 的组织学定位, 实验还成功构建了DjHSP70 表达载体, 在IPTG 诱导下表达出约76 kD 的融合蛋白。Djhsp70 cDNA 的克隆与表达载体的构建为下一步工作奠定了基础。       

VEGF 对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制研究

目的:研究局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡、HSP70蛋白表达时空规律以及外源VEGF及VEGF抗体对它们的影响,探讨VEGF对缺血再灌注损伤的保护作用及其机制.方法:采用原位末端标记(TUNEL)、免疫组化方法,研究局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡数及HSP70蛋白表达时空分布,采用脑表面使用VEGF及侧脑室注射VEGF抗体,观察内外源VEGF对它们的影响.结果:VEGF抗体能显著增加缺血侧脑组织凋亡细胞数(再灌注12h-7d)及HSP70表达量(再灌注1-3d),而外源VEGF因子能显著减少同侧脑组织凋亡细胞(再灌注全程)及HSP70表达量(再灌注1-3d).结论:VEGF因子可抑制缺血脑组织细胞凋亡及HSP70表达量,提示VEGF参与保护缺血性脑损伤.     

HSP70在放线菌素D所致肺腺癌细胞增殖抑制和凋亡中的作用

为探讨热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)在肺腺癌中的表达及其作用,首先采用免疫印迹检测经临床支纤镜确诊并行手术切除的肺腺癌组织标本中HSP70的表达,结果显示在癌旁正常组织中HSP70的表达量显著低于其在癌组织中的表达量.其次,采用HSP70反义寡核苷酸阻断A549细胞中HSP70表达后,经MTT和Hoechst33258检测发现,HSP70下调能显著促进放线菌素D(actinomycinD,ActD)所致的A549细胞增殖抑制及凋亡,反义寡核苷酸处理组与正义或随机寡核苷酸处理组比较P值均小于0.05.进一步构建HSP70真核重组质粒并瞬时转染A549细胞后,能显著增加A549细胞中HSP70表达,同时采用MTT和流式细胞术及基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测发现,HSP70过表达能显著抵消ActD所致细胞增殖抑制及凋亡,转染HSP70重组质粒组与转染空载体组相比P值小于0.05.上述结果提示,HSP70在肺腺癌组织中高表达,高表达的HSP70在降低肺腺癌细胞对ActD的敏感性及促进癌细胞增殖与抑制凋亡等方面发挥了重要作用.     

地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响

目的 分析地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响.方法 根据芽孢杆菌的使用量设置测试1组(LDG,用菌量2.0×103 CFU/mL),测试2组(HDG,用菌量1.0 × 104 CFU/mL)及未使用芽孢杆菌的对照组(CG),每7d施菌1次,实验持续24 d.每6d取样对虾肌肉和肝胰腺检测Toll基因和HSP70基因的mRNA相对表达量.结果 对虾肝胰腺Toll基因mRNA表达量在LDG组和HDG组分别较CG组提高了410.05％和78.31％,但在肌肉中CG组的表达量则分别较LDG组和HDG组提高了31.81％和8.43％.可见,芽孢杆菌在一定程度上可提高Toll基因mRNA在对虾肝胰腺的表达,但对其在肌肉中的表达则呈一定的限制作用.在肝胰腺HSP70基因的mRNA表达量,HDG组显著高于CG组和LDG组(P＜0.05),CG组和LDG组的差异无统计学意义(P＞0.05);在肌肉中LDG组和HDG组的HSP70基因mRNA表达分别较CG组提高了26.07％和26.46％,但实验组的组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在水体中施用芽孢杆菌104 CFU/mL和2.0×103 CFU/mL可分别提高对虾肝胰腺和肌肉HSP70基因的mRNA表达量.     

全氟辛烷磺酸盐对胚胎期大鼠雄性生殖系统的影响

目的:研究全氟辛烷磺酸盐(PFOS)对胚胎期大鼠雄性生殖系统发育的影响.方法:PFOS分别以5、10、20 mg· kg-1·d-1灌胃染毒孕12-19天的SD母鼠,染毒结束后,测量雄性胎鼠体重、身长、睾丸重量、AGD;酶联免疫吸附法检测雄性胎鼠睾丸内睾酮水平;实时荧光定量PCR法测睾丸组织类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胰岛素样因子3(INSL3)mRNA的相对表达量.结果:与对照组相比,高剂量染毒组雄性胎鼠体重、体长、AGD长度显著降低(P＜0.01),睾丸重量减轻(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸中内睾酮水平下降(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸组织中StAR mRNA的表达量降低(P＜0.05),而中剂量染毒组StAR mRNA和INSL3 mRNA表达量则明显升高(P＜0.01).结论:孕期染毒PFOS对雄性胚胎生殖系统的发育有毒性作用,其机制可能与PFOS影响睾酮合成和INSL3 mRNA的表达有关.     

肌肽对大鼠缺血-再灌注损伤后热休克蛋白70及炎性因子表达水平的影响

目的通过失血性休克大鼠血液回输后造成的缺血-再灌注损伤（IRI）模型,研究肌肽对IRI后丙二醛（malondialdehyde,MDA）浓度、热休克蛋白70（HSP70）及炎性因子表达水平的影响。方法27只Wistar大鼠随机分成3组制作IRI模型,大鼠失血至40mmHg→雌持20min→放置1h→全血回输→维持3h→处死。大鼠处死后取血浆检测MDA浓度,取肝、脑、肺、心、肾、脾组织制作石蜡切片,通过免疫组化染色比较肝、脑、肺、心、肾、脾组织切片HSP70阳性细胞数;取肝组织提取RNA比较肝组织HSP70及炎性因子mRNA表达量。结果与再灌损伤组相比,肌肽治疗组肝、脑、肺、心、肾、脾组织切片HSP70阳性细胞数及HSPa5、HSPala mRNA表达量明显升高;MDA浓度及IL-6、TNF-α、NF-κB1、SCYA2、SCYA3 mRNA表达量明显降低。结论肌肽可以抑制IRI后MDA的生成、从mRNA水平促进HSP70的表达、抑制炎性因子mRNA的表达。     

吐温80对体外HeLa细胞的杀伤抑制

研究吐温80对体外培养HeLa细胞的杀伤抑制。通过MTT法检测并观察了不同浓度吐温80、大肠杆菌内毒素(LPS)及前列腺素E1(PGEI)对体外培养HeLa细胞作用后细胞抑制率;将作用后细胞裂解液经SDS-PAGE及Western-blotting法测定其热休克蛋白70(Heat Shock Protein70,HSP70)表达。结果:0.02％吐温80具有明显杀伤HeLa细胞的作用,且作用后的HeLa细胞几乎无HSP70蛋白表达(正常HeLa细胞有一定量HSP70蛋白表达),但却有一种分子量为70kDa的蛋白高表达,表明吐温80显著抑制HSP70表达,以至HeLa细胞死亡,同时促使某一种蛋白大量堆积。大肠杆菌内毒素、前列腺素E1对HeLa细胞无明显抑制杀伤作用,且与吐温80无明显协同效应,同时亦对HeLa细胞HSP70表达无显著影响。推测:吐温80对HeLa细胞HSP70表达的显著抑制作用可能是其杀伤HeLa细胞的 作用机制之一,为理想的温热治疗肿瘤的协同合并作用药物,但其使细胞内大量某70kDa蛋白堆积现象有待进一步探讨。     

热休克蛋白在高温致神经管畸形中的表达

目的：检测热休克蛋白在高温致神经管畸形中的表达状况,以探讨高温致神经管畸形的机制。方法：在高温致金黄地鼠神经管畸形的动物模型上,利用免疫组织化学(SABC法)方法,检测高温致神经管畸形中,热休克蛋白(HSP70和HSP90)在神经上皮细胞及周围间充质细胞中的表达状况;同时利用地高辛标记的寡核苷酸探针进行原位杂交,检测HSP70 mRNA和HSP90 mRNA在神经上皮细胞及周围间充质细胞中的转录状况。结果：高温处理后2h,鼠胚神经上皮细胞及周围间充质细胞HSP70、HSP90的表达与正常对照组相比明显增强,8h和16h的表达达到高峰,24h后与对照组水平一致。原位杂交结果显示,高温处理后2h神经上皮细胞及周围间充质细胞中出现HSP70 mRNA及HSP90mRNA杂交阳性信号,8h阳性信号最强,16h后阳性信号减弱,至24h后未见阳性信号。结论：高温可引起神经上皮细胞及其周围间充质细胞HSP70和HSP90应激性表达,这可能是胚胎受到高温作用后发生的一种保护性反应。     

豚鼠庆大霉素耳中毒后HSP70 mRNA的表达

为探讨热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70mRNA在庆大霉素(gentamicin,GM)耳中毒中的意义,本实验选用耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠(200~250g)20只,雌雄不拘,随机分成两组,每组10只。实验组动物每日腹腔注射GM100mg/kg;对照组动物每日腹腔注射与GM等量的生理盐水2.5ml/kg。两组动物混合饲养,均连续用药10d。在用药前1天和停药后第1天进行听脑干反应(auditorybrainstemresponse,ABR)测试。各组豚鼠在行第二次ABR检测后,应用原位杂交及图像分析技术观察GM耳中毒后HSP70mRNA在豚鼠耳蜗中表达。结果显示:实验组耳蜗ABR阈值明显高于对照组,有显著性差异(P<0.01);实验组豚鼠耳蜗血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节细胞HSP70mRNA表达呈强阳性,其平均灰度值较正常对照组明显减小(P<0.001),即GM能显著增强耳蜗HSP70mRNA的表达。结果提示,GM中毒后,动物可能通过增加HSP70mRNA在耳蜗的表达,起保护听力的作用。     

日本三角涡虫Caspase-7基因的克隆及功能研究

本文以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象,通过c DNA末端快速扩增技术首次克隆得到了涡虫Caspase-7基因,全长935 bp,编码251个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR长度分别为86 bp和93 bp。涡虫Caspase-7具有Caspase家族保守而关键的LSHG与QAC(Q/R) G两大结构域。此外,基于SWISS-MODEL同源建模对涡虫Caspase-7蛋白三维结构的预测和分析,发现其包含2个催化单位,且潜在催化位点由4个表面环构成。进化分析也显示,涡虫Caspase-7基因未与扁形动物门Platyhelminthes物种聚为一支,而与刺胞动物门Cnidaria水螅Hydra vulgaris有较近的亲缘关系,说明Caspase-7基因可能发生了趋同进化。本文通过实时荧光定量PCR检测了Caspase-7基因在涡虫再生不同时间段的表达变化,发现在涡虫切后再生6 h和3 d,Caspase-7基因表达量升高,这2个时间点是涡虫切后凋亡发生的2个高峰期。此外,通过喂食ds RNA干扰涡虫体内Caspase-7基因的表达,结果发现,干扰Caspase-7基因并不影响涡虫的再生,但再生完成后或未切割的成体涡虫在饥饿环境下,受Caspase-7基因干扰,虫体逐渐溶解直至死亡,而Djclg-3及PCNA基因的表达量也显著降低,说明干扰Caspase-7基因表达可能引起涡虫细胞凋亡与增殖减少,涡虫组织重塑失衡,导致虫体溶解并死亡。该结果揭示Caspase-7基因可能在涡虫组织重塑中起关键作用。     

Hsp70 对低氧大鼠海马DG 区神经细胞p53、p-p38 表达的研究

目的:探讨热休克蛋白70(HSP70)高表达对低氧大鼠海马DG区神经细胞p53、p-p38表达的影响。方法:将大鼠海马DG区神经细胞在41℃温浴1h诱导HSP70高表达,然后低氧培养,Western-blot检测细胞HSP70、p53、p-p38的表达。结果:温浴可以诱导HSP70高表达;HSP70高表达可抑制p53和p-p38表达。结论:HSP70保护低氧诱导的细胞凋亡可能与抑制p53和p-p38表达有关。     

8周不同强度运动对大鼠股四头肌HSP70和VEGF的影响

目的:研究不同强度运动的应激条件下,大鼠股四头肌保护性蛋白热休克蛋白70(HSP70)和血管生长因子(VEGF)表达的情况,为运动健身和科学训练提供研究资料。方法:采用任昭君的运动方案模型、参照Bedford及孙晓娟的运动负荷标准。分为四组(n=8):对照组(C组)、小强度运动组(LE组)、中等强度运动组(ME组)和大强度运动组(HE组),每周训练5 d共8周。取大鼠右肢股四头肌组织,采用免疫组织化学技术检测VEGF和HSP70的表达。结果:与对照组相比较,实验各组的股四头肌VEGF蛋白表达明显增加(P<0.01),分别增加了284.8%、63.02%和386.88%,而HSP70蛋白表达分别增加了11.57%、18.54%和3.75%;其中LE组和ME组的HSP70蛋白表达显著增高(P<0.05),HE组的HSP70蛋白表达未出现显著性变化(P<0.05),而ME组比LE组的HSP70蛋白表达增加明显(P<0.05),均高于HE组的HSP70蛋白表达。结论:中低强度运动诱导股四头肌HSP70合成表达,相应的VEGF表达增加;8周小强度有氧递增性运动对大鼠的机体影响非常显著。     

中华蜜蜂热休克蛋白70的克隆、表达及中蜂囊状幼虫病毒感染后表达差异分析

[目的]本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70 (Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系.[方法]首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(NO.MH122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化.[结果]成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位.利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高.[结论]通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助.     

过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力

通过在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中过表达热休克蛋白70以提高其表达抗体的能力。首先从中国仓鼠基因组DNA中扩取HSP70基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70,再将重组质粒稳定转染到CHO/dhfr-细胞中,筛选获得稳定的细胞系,运用RT-qPCR检测和Western blot分析HSP70基因的过表达。在过表达HSP70的CHO细胞组和对照细胞组(转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞组)中分别转染表达抗-HBs的质粒,应用ELISA检测两组细胞表达抗-HBs的能力。RT-qPCR结果显示实验组CHO细胞中HSP70基因的表达量明显高于对照组细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞组抗-HBs表达量高于对照组细胞(P<0.05)。研究揭示HSP70能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达。     

日本三角涡虫体内Djcullin1基因和Djtinp1基因的相互作用研究

Cullin1蛋白是细胞周期进展的重要参与者,也是泛素连接酶E3的重要骨架蛋白.TGF-β信号通路在涡虫再生中发挥着重要作用,其下游分子TGF-β诱导核蛋白(Tinp1)也参与日本三角涡虫Dugesia japonica再生.虽然 cullin1基因和tinp1基因在涡虫体内均呈阳性表达,但二者之间的关系还不清楚.本研...     

热休克蛋白在宫颈癌和癌前病变中的表达

目的：研究几种主要热休克蛋白（HSPs）在宫颈癌和癌前病变组织中的表达。方法：根据病理诊断,把478例宫颈活检标本分为宫颈癌组（63例）、宫颈上皮内瘤（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）组（106例）、宫颈炎组（293例）及正常宫颈组（16例）。采用以特异性复合cRNA为内参照的定量RT-PCR法,检测各组标本的HSP70、HSP90α和HSP90β mRNA的表达。结果：①HSP70、HSP90α和HSP90βmRNA在宫颈浸润癌、CIN、宫颈炎及正常宫颈组织中的表达量均呈现阶梯式下降．差异均有极显著意义（P〈0．01）。②HSP90βmRNA在晚期（FIGOⅡb-Ⅳ）宫颈癌中的表达比早期（FIGOⅠ-Ⅱa）表达高（P〈0．05）。③HSP70和HSP90βmRNA在低分化宫颈癌中的表达比高分化表达高（P〈0．05）。④HSP70、HSP90α和HSP90βmRNA在不同组织类型宫颈癌中的表达均无显著性差异（P〉0．05）。结论：热休克蛋白在宫颈癌的发生和发展中起着重要的协同作用。HSP70和HSP90α与宫颈癌细胞的转化和增殖密切相关,HSP90β可能参与细胞的分化。     

HSP27 特异性shRNA 表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株 SW1990/Gem 中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞外泌体miR-190a-5p通过靶向KLF15抑制肺癌细胞迁移和侵袭

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体miR-190a-5p对肺癌细胞的影响。方法:通过超速离心获得BMSCs外泌体,透射电镜观察外泌体形态,采用纳米颗粒示踪分析(NTA)检测外泌体粒径,利用Western印迹检测外泌体上的标志蛋白CD63、CD9及HSP70;选取肺癌细胞系A549、LK79、H1975和HCC827,以及人正常上皮细胞BEAS-2B检测对比miR-190a-5p在这些细胞中和BMSCs衍生的外泌体(BMSC-exosome)中的表达量;双萤光素酶报告基因检测验证Krüppel样因子15(KLF15)是否为miR-190a-5p的靶基因;定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测miR-190a-5p对KLF15的表达调控;Transwell法检测外泌体对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:BMSCs外泌体呈圆形,粒径集中在150～200 nm,标志蛋白CD63、CD9及HSP70阳性表达;BMSCs外泌体中miR-190a-5p的相对表达量均高于在4种肺癌细胞及正常肺细胞BEAS-2B中的表达;双萤光素酶报告基因检测KLF15是miR-190a-5p的靶基因;BMSCs外泌体与miR-190a-5p mimics均能使肺癌细胞中的miR-190a-5p含量升高,并抑制KLF15的mRNA和蛋白表达,从而抑制肺癌细胞迁移和侵袭。结论:BMSCs外泌体miR-190a-5p通过下调KLF15抑制肺癌细胞迁移和侵袭,为肺癌的诊断和治疗提供了新的思路。     

褐飞虱HSP70与HSP90基因特性及温度诱导表达

[目的]研究不同温度条件下,褐飞虱HSP70和HSP70基因的表达变化,探索HSP蛋白在褐飞虱对温度胁迫适应中的作用。[方法]利用同源克隆方法获得HSP70A和HSP70基因序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HSPs基因在不同温度诱导下的表达量。[结果]褐飞虱HSP70A基因包含1 896 bp的ORF,编码631个氨基酸; HSP70基因包含2 193 bp的ORF,编码730个氨基酸。HSP70A在38℃高温下,表达量出现不同程度下降; HSP70B和HSP70在32℃及38℃高温下能够被诱导高表达。在低温诱导下,HSP70A及HSP70B的表达出现不同程度下降(HSP70A在15℃处理6 h及10℃处理2 h例外),HSP70表达量在低温下为显著或者极显著上升。[结论] HSP70B和HSP70在褐飞虱的高温胁迫下起重要的作用;在低温下则主要通过提高HSP70的表达来保护机体内细胞的正常生理代谢。