Nr4a2过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建含Nr4a2基因的绿色荧光慢病毒载体,并检测其体外表达目的基因的水平。方法:设计Nr4a2基因的引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增,插入经AgeⅠ/AgeⅠ酶切的GV287慢病毒载体构建GV287-Nr4a2慢病毒质粒。PCR鉴定、测序验证后,将其与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体共同转染293T细胞(人胚肾细胞),48小时后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,经浓缩并测定滴度后感染293T细胞,72h后观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组慢病毒载体GV287-Nr4a2;荧光显微镜下可见绿色荧光高度表达;Nr4a2蛋白能在293T细胞中有效表达;包装过表达慢病毒并测其浓缩滴度为2.0×108TU/ML。结论:成功构建Nr4a2慢病毒载体且在293T细胞中良好表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞,基因治疗帕金森病奠定基础。     

猪miR-486慢病毒表达载体的构建及鉴定

mi R-486在肌肉生长发育和肌肉疾病的发生中具有重要的功能,本研究旨在构建猪mi R-486慢病毒表达载体,鉴定其在巴马小型猪成纤维细胞中过表达水平,并利用胞质注射生产转基因胚胎,为研究mi R-486在肌肉生长发育中的功能奠定基础。以巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增mi R-486前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入p CDH-CMV-MCS-EF1载体,构建LV-mi R-486慢病毒表达载体;在巴马小型猪成纤维细胞中过表达mi R-486并利用Real-time PCR验证其过表达效率,通过胞质注射生产转mi R-486的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了LV-mi R-486重组载体,将慢病毒载体转染巴马小型猪成纤维细胞后mi R-486上调,经胞质注射后在胚胎发育早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本研究成功构建了猪mi R-486慢病毒表达载体,在巴马小型猪成纤维细胞中过表达并生产出转mi R-486的阳性胚胎,为后续研究mi R-486的功能奠定基础。     

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

OTX1基因慢病毒载体的构建及过表达研究

OTX1基因是神经发育调控中关键转录因子之一。本实验构建表达OTX1基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导OTX1基因体外过表达的可行性。将OTX1基因克隆到慢病毒穿梭质粒DUET101内,构建表达OTX1以及GFP－OTX1基因的慢病毒载体;将pDUET－OTX1、pDUET－GFP－OTX1及pDUET101（空载体对照）质粒分别与慢病毒包装质粒pCMV R8.91、pMD.G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OTX1基因、GFP－OTX1基因的重组慢病毒DUET－OTX1、DUET－GFP－OTX1以及仅携带GFP基因的DUET－GFP;用重组慢病毒分别转导293T细胞、SY5Y细胞、小鼠胚胎干细胞及大鼠胚胎15天皮层神经干细胞,证实慢病毒载体能够将外源基因转导入不同细胞,且转导的OTX1或GFP－OTX1在不同细胞中均仅在细胞核内表达;培养OTX1单克隆抗体细胞,浓缩抗体上清,通过Western Blot以及细胞免疫荧光法证实慢病毒介导的OTX1基因及GFP－OTX1基因转导入293T细胞后的过表达。本实验证实慢病毒载体是高效的基因转移载体;OTX1作为发育过程中至关重要的转录因子,经过重组慢病毒体外转导后均只在细胞核内表达。     

EGFL7 基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）重组慢病毒表达载体。方法：参照小分子干扰RNA 的设 计原则,应用OligoDesigner 3.0 软件设计三条靶向人EGFL7 基因的RNA干扰序列（hEGFL7-RNAi）,并将其分别插入含有绿色 荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pLV3 中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE 和pMD2G共同转染293T细胞,包 装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR 检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后靶基因mRNA 的水平,以评价 其基因沉默效果。结果：筛选出3 条人EGFL7 基因的RNAi 序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1× 108、2× 108和5× 108TU/mL,将其转染入HUVEC 后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P<0.05)。结论：成功筛选出三条针对人EGFL7基因的 RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs 中EGFL7 基因的表达。     

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体的构建和鉴定

本试验旨在构建广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体,以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,利用PCR扩增miR-181b前体序列,构建重组质粒p LV-miR-181b,经PCR和测序鉴定,阳性重组质粒转染C2C12细胞,荧光倒置显微镜下检测转染效率。结果显示,miR-181b前体序列长度为377 bp,与预期片段序列长度一致。将鉴定为阳性的miR-181b重组质粒转染C2C12细胞48 h后,在荧光显微镜下检测到较强的绿色荧光蛋白的表达,说明重组miR-181b质粒在C2C12细胞中具有较高的表达活性。本研究成功构建了具有高表达活性的miR-181b重组慢病毒表达载体,为研究miRNA-181b调控骨骼肌生长发育的功能机制提供实验基础。     

hsa-miR-20a低表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

目的:构建hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,检测其在HL-60中表达。方法:采用In-fusion重组交换克隆法设计并合成hsa-mi R-20a前体序列的扩增引物,扩增获得目的片段插入慢病毒GV159中,得到重组的LV-hsa-mi R-20a表达载体,通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带hsa-mi R-20a的重组慢病毒并测定病毒滴度。取对数生长期HL-60细胞根据病毒滴度及细胞MOI值感染慢病毒,感染后24 h、48 h、72 h、96 h镜下观察荧光表达情况,判断感染效率,q RT-PCR检测HL-60细胞hsa-mi R-20a的表达变化。结果:成功构建LV-hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,其病毒滴度为(8E+8)TU/m L。该病毒感染HL-60细胞的效率可高达到80%,并可有效降低HL-60细胞hsa-mi R-20a表达水平。结论:成功构建了hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,包被的慢病毒可以在HL-60细胞中实现低表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

Netrin-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。     

小鼠Sema4D慢病毒过表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠Sema4D慢病毒过表达载体。方法采用Gateway技术将体外合成小鼠全长Sema4D基因插入并重组到预先已经插入荧光标记基因片段IRES的质粒中,阳性菌落由Ampicillin筛选后,大量繁殖,获得大量转染后的质粒,经过测序鉴定后,经慢病毒包装,转染293T细胞,经由Neomycin筛选,获得高滴度的病毒液。结果测序结果显示Sema4D基因共有2 586 bp,重组慢病毒载体共有11 966bp,其中Sema4D插在CMV启动子和IRES标记序列之间,位置为2569-5144。测序结果表明小鼠Sema4D基因已经成功构建到过表达慢病毒载体中。结论小鼠Sema4D基因慢病毒过表达载体Lenti-CMV-sema4D-IRES-PGK-neo能够正确构建,该载体为研究小鼠Sema4D基因在特定细胞内过表达株的筛选奠定基础,为其作用机制的研究提供用力工具。     

慢病毒介导的下丘脑中过表达miR-505小鼠模型的构建

目的:本文用慢病毒定点注射的方法构建了在下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,并利用荧光原位杂交方法在冰冻切片组织上快速检测mi RNAs,以确认慢病毒载体介导的mi R-505在丘脑中的表达能力。方法:实验小鼠在脑立体定位仪下定位到下丘脑位置,采用原位注射的方式进行慢病毒注射,注射后采用实时荧光定量RCR和应用了LNA探针和TSA系统的FISH(fluorescence in situ hybridization)技术,完成在慢病毒介导的mi R-505过表达老鼠下丘脑区域细胞中的mi R-505检测和示踪。结果:mi R-505慢病毒注射未成年小鼠下丘脑区5、10、20和40天后,均可检测到mi R-505在下丘脑区域的表达,且实验结果表明在慢病毒介导的过表达小鼠下丘脑注射部位,mi R-505表达量有明显的提高。结论:利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法,成功的建立了下丘脑中过表达mi R-505的小鼠模型,使用LNA标记探针的FISH方法探索mi RNA表达规律较稳定,且重复率高。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。     

hNoc4L基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定

核糖体前体的形成和核运输需要多种核仁复合物的参与,hNoc4L是酿酒酵母S.cerevisiae的核仁复合物相关蛋白4的同源蛋白,并含有保守的Noc结构域,但其功能未知。为了构建hNoc4L基因过表达的慢病毒载体,本实验通过将EF1α启动子替换原shRNA慢病毒载体pll3.7的U6启动子,成功构建了慢病毒表达载体pll3.7-EF1,并进一步得到了hNoc4L基因过表达的慢病毒载体。利用慢病毒包装系统对不同物种的细胞进行感染,以此检测该重组慢病毒载体的包装效率,并通过构建的hNoc4L过表达的RAW264.7稳定细胞系检测了该载体的免疫原性和稳定转染能力。结果表明成功构建了高效、长期稳定表达和免疫原性低的hNoc4L特异性表达的慢病毒载体,为进一步研究hNoc4L蛋白在哺乳动物核糖体生物发生中的调控作用奠定了基础。     

EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立

利用PCR方法合成EEF1A2的基因全长,经NotⅠ和NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体pGLV5-EF1a-EGFP/Puro上。构建的重组质粒pGLV5/EEF1A2经PCR、酶切及测序鉴定正确后,利用慢病毒表达系统(pGLV5 Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pVSV-G,pGag/Pol,pRev)4质粒共转染293T细胞,收集培养上清并感染人胰腺癌SW1990细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株EEF1A2/SW1990。Real-time PCR和West-ern blot检测结果显示EEF1A2在EEF1A2/SW1990细胞中表达较原代细胞明显增高(P<0.05),MTT结果显示EEF1A2/SW1990细胞的增殖能力亦较原代细胞显著增强(P<0.05)。成功构建了EEF1A2基因的慢病毒载体质粒pGLV5-EEF1A2及其慢病毒表达系统,并筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株EEF1A2/SW1990。     

EGFL7基因RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定（英文）

目的:构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒表达载体。方法:参照小分子干扰RNA的设计原则,应用Oligo Designer 3.0软件设计三条靶向人EGFL7基因的RNA干扰序列(h EGFL7-RNAi),并将其分别插入含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pLV3中,获得重组质粒,与包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G共同转染293T细胞,包装产生重组慢病毒,培养72 h后,应用qRT-PCR检测慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后靶基因mRNA的水平,以评价其基因沉默效果。结果:筛选出3条人EGFL7基因的RNAi序列,分别包装出重组慢病毒,其滴度分别为1×10~8、2×10~8和5×10~8TU/mL,将其转染入HUVEC后,EGFL7mRNA表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:成功筛选出三条针对人EGFL7基因的RNAi有效靶序列,并成功构建重组慢病毒表达载体,证明该序列可沉默HUVECs中EGFL7基因的表达。     

广西巴马小型猪miR-423-5p基因慢病毒载体构建和鉴定及其在骨骼肌中的表达

本试验的目的在于检测广西巴马小型猪骨骼肌中mi R-423-5p基因的表达情况及构建p LV-mi R-423-5p慢病毒载体并在C2C12细胞中进行验证。通过q RT-PCR方法检测背最长肌中mi R-423-5p的表达,设计特异性引物对mi R-423-5p基因的前体序列进行扩增并定向克隆到慢病毒载体p LV-CMV-mcs-3xflag-EF1-GFP(p LV)上,鉴定正确的重组质粒用脂质体转染法转染进C2C12细胞,q RT-PCR检测mi R-423-5p的表达情况。结果表明广西巴马小型猪背最长肌中mi R-423-5p的表达水平随着月龄的增长而不断上升,同时成功构建了p LV-mi R-423-5p慢病毒载体。该项研究为进一步寻找mi R-423-5p基因调控骨骼肌生长发育的机制提供理论基础,对肉质性状分子改良提供有益的线索。     

miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

RNA干扰USE1基因慢病毒载体的构建及鉴定

旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%(*P0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。     

shRNA慢病毒载体稳定抑制LRP16 表达的HepG2 细胞的构建及鉴定

目的:构建LRP16基因抑制表达的Hep G2稳定细胞系,鉴定其LRP16基因抑制表达的效果。方法:构建LPP-HSH008357-LVRH1GP-200短发卡RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,用该抑制表达慢病毒感染Hep G2细胞系,通过荧光筛选及药筛,获得LRP16基因稳定抑制表达细胞系;最终运用Q-PCR和Western blot鉴定该稳定细胞系中LRP16的表达。结果:构建了LRP16基因抑制表达及抑制表达对照的Hep G2稳定细胞系,并通过Q-PCR和Western blot进行了鉴定。Q-PCR结果显示相对于对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)LRP16基因的抑制效率是4组抑制表达细胞中效果最理想的一组,其抑制效率高达98%;Western blot结果也显示该抑制表达稳转株(LPP-HSH008357-7-LVRH1GP-200)的LRP16蛋白表达量明显低于野生型Hep G2细胞及对照稳转株(LPP-CSHCTR001-LVRH1GP-100),其结果与Q-PCR一致。结论:构建并鉴定了人LRP16基因抑制表达Hep G2稳定细胞系及其相应的对照稳转株。