植物防御素PD5基因在毕赤酵母中的分泌表达

将植物防御素PD5基因克隆到载体pPIC9的XholⅠ和EcoRⅠ位点之间,得到重组载体pPIC9／PD5。pPIC9／PD5经Bgt Ⅱ线性化,电转化法转入Pichia pastoris GS115,MD和MM平板筛选表型为His^＋Mut^S的转化子,PCR鉴定阳性转化子。转化子D24用BMGY培养至OD600为6．0时,经BMM诱导,上清液用Tricien—SDS—PAGE可检测到目标条带。同时经平板抑菌试验显示,D24的诱导发酵上清液可很好的抑制香蕉枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense）及甘蓝黑腐菌[Xanthomona campestris（Smith）Dovosen]的生长。植物防御素PD5基因在毕赤酵母中得到表达。     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究

为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将几种抗菌肽串联起来在毕赤酵母中表达,并比较其与单独抗菌肽的抑菌活性。以GenBank中的Protegrin-1(PG-1)、ScorpionDefensin(SD)、Metalnikowin-2A和SheepMyeloidAntibacterialPeptide(SMAP-29)(序列号分别为AAB27599,AAAB27538、P80409和P49928)成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)偏好密码子,设计并人工合成复合抗菌肽pl基因,同时用SOE法获得ScorpionDefensin的基因,分别克隆到pPICZαA载体中,转化P.pastoris受体菌X-33,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,复合抗菌肽PL及SD均获得表达。体外抑菌试验检测复合抗菌肽PL与单独的蝎子防御素SD的热稳定性、酸稳定性、最低抑菌浓度等,结果显示复合抗菌肽PL及SD具有很强的热酸稳定性,而针对不同的细菌,复合抗菌肽则表现出了强于单独的SD的活性,特别是对大肠杆菌。上述结果说明了该复合抗菌肽具有很好的开发前景。     

猪防御素PD基因表达载体的构建

目的：构建猪防御素PD基因表达载体。方法：化学合成经过适当改造的带有双酶切位点的PD基因,将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达质粒PinPoin^TMXa-3的多克隆位点构建表达质粒。结果：构建的表达载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,表明PD基因表达载体构建成功。结论：PD基因表达载体的构建,为进一步获得PD基因的表达产物,研究其抗菌活性、抗菌机理打下基础。     

TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达*

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

抗IV型胶原酶单链抗体在毕赤酵母中分泌表达*

利用毕赤酵母系统表达抗 IV型胶原酶人单链抗体。首先把目的基因克隆到毕赤酵母表达载体上 ,电击转化受体菌。在甲醇诱导下表达单链抗体。 SDS- PAGE和免疫印迹显示毕赤酵母分泌表达人单链抗体 ,表达量约 2 0 mg/ L酵母培养物。该表达系统与大肠杆菌相比 ,简化了表达产物的分离纯化程序。     

家蚕抗菌肽在毕赤酵母中的表达

目的：用毕赤酵母真核系统表达有抑菌活性的家蚕抗菌肽(cecropin-XJ)。将pGEX-4T-1-cecropin-XJ上的抗菌肽基因cecropin—XJ克隆至穿梭质粒pSuperY上,用Bln Ⅰ酶切使之线性化后,采用电击法转化酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵,经SDS—PAGE检测,表达产物可以在α信号因子的引导下,分泌到培养基中,且表达产物具有明显抑菌活性。     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达*

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb:AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases fam ily 10,与来源于Geobacillus stearotherm ophilus的intra-cellu larxylanase在氨基酸水平具77%同源性。该基因经T4 DNA poly     

杂合抗菌肽CecA-mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastorts)偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA-mil基因,改造后的CecA-mil基因克隆到pPICZα-A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-CM,转化Pichia pastoris受体菌X-33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1．9kD的CecA-mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg／mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G^-菌及G^ 菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

基于重组毕赤酵母的斑点叉尾鮰β-防御素表达

β-防御素是斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus抵御病原微生物侵染的首要蛋白质免疫因子,其一级结构包含氨基端24个氨基酸组成的信号肽和羧基端43个氨基酸组成的成熟肽,该成熟肽赋予β-防御素的生物学活性。文中首次构建了产斑点叉尾鮰β-防御素的毕赤酵母Pichiapastoris重组菌株,实现了基于真核表达的斑点叉尾鮰β-防御素的生物合成。首先通过RT-PCR从斑点叉尾鮰皮肤中分离β-防御素成熟肽基因"IPBD",将其与表达载体p PICZαA连接并转入毕赤酵母X-33后,获得重组毕赤酵母菌株;经含1 000μg/m L博来霉素的培养基筛选,获得高拷贝重组菌株。以BMM培养基(无氨基氮源培养基)替代BMMY培养基(含氨基氮源培养基),对重组菌株的发酵培养条件进行优化,确定其产斑点叉尾鮰β-防御素的最适条件为:28℃、250 r/min、1.0%甲醇诱导表达96 h。重组菌株产物经镍离子亲和层析获得分子量为5.98k Da的纯化蛋白,基于MALDI-TOF-TOF的质谱分析证明该纯化蛋白为重组IPBD。抑菌活性测定结果表明重组IPBD对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌Staphyloco...     

人α防御素5在酿酒酵母中的分泌表达及其活性分析

人α-防御素5(humanα-defensin 5,HD5)是人防御素α家族中发现的抑菌活性最高的多肽。为了探究HD5在酿酒酵母中分泌表达的可行性,首先利用PCR扩增获得酵母菌偏好的HD5核酸序列,构建酿酒酵母表达载体pVT102U/α-HD5,并将该重组质粒转入酿酒酵母S78中,通过营养缺陷筛选获得阳性转化菌株。然后,对重组菌进行发酵培养,取上清液纯化后通过tricine-SDS-PAGE和质谱检测表达产物。最后,利用琼脂扩散法检测表达的HD5的抑菌活性以及其对温度的耐受性,同时通过二倍稀释法检测表达的HD5对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏杆菌的最小完全抑制浓度。结果显示:表达的HD5对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏杆菌均具有明显的抑菌活性。发酵上清冻干粉对金黄色葡萄球菌完全抑制的最小浓度为10 mg/mL,对大肠杆菌和沙门氏杆菌完全抑制的最小浓度为40 mg/mL;且在不同温度处理下,表达的HD5对3种细菌仍具有一定的抑菌作用。上述结果表明具有高抑菌活性的HD5防御素在该重组系统中成功表达。     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′端引入KEX2基因产物(Kex2)的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA-Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500μg/mL的Zeocin筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。       

西瓜防御素基因ClPDF2.1的克隆及表达分析

该研究从西瓜中克隆了西瓜防御素基因ClPDF2.1(GenBank登录号为KC481267)。序列分析结果表明,ClPDF2.1基因开放阅读框为225bp,编码75个氨基酸,预测蛋白质分子质量为8.237kD,等电点为9.375。蛋白质结构分析表明,ClPDF2.1蛋白含有防御素特有的8个半胱氨酸结构域。进化分析显示,ClPDF2.1与拟南芥PDF2归为一类,与五彩椒的亲缘关系最近(59%)。荧光定量PCR分析表明,ClPDF2.1在西瓜根、茎、叶器官中都有表达,叶中表达量高于根,茎中表达量最低。ClPDF2.1基因的表达也受到外源植物激素水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利和西瓜枯萎病菌的诱导上调,表明ClPDF2.1基因通过信号传导途径参与对西瓜枯萎病菌株的防御反应。西瓜防御素基因的克隆及表达分析为其功能鉴定奠定了基础。     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母( Pichia pastoris) 密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′ 端引入KEX2基因产物（Kex2）的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA 载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA_Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的Zeocin 筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100 mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。     

虎纹镇痛活性肽在毕赤酵母中的分泌表达

虎纹镇痛活性肽HWAP-Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛初毒中分离纯化,具有镇痛活性的多肽类神经毒素.为了在P.pastoris中高效分泌表达HWAP-Ⅰ,依照RT-PCR的结果,人工合成编码虎纹镇痛活性肽的基因片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒pPIC9K-HWAP-Ⅰ.转化GS115宿主菌后,筛选出整合型His⁺Mut^S表达菌株.经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证明HWAP-Ⅰ在毕赤酵母中能有效分泌表达,产物的分子质量为4 ku左右,产量达80 mg/L.体外小鼠输精管阻断实验证实表达产物具有明显的生物活性.     

杂合抗菌肽CecA_mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA_mil基因,改造后的CecA_mil基因克隆到pPICZα_A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα_A_CM,转化Pichia pastoris受体菌X_33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9 kD的CecA_mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg/mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G－菌及G＋菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA_mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响*

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的