大麦条纹花叶病毒新疆株RNA5′-末端帽子结构的鉴定

在弱碱条件下一些RNA病毒蛋白外壳可以特异性地从RNA5＇-末端开始剥落,对大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA以含帽子结构的TMV-RNA和不含帽子结构的CpMV-RNA为正,负对照,在弱碱条件下剥壳,用合成的pCp特异性地标记RNA5＇-末端帽子结构上的3＇-羟基,经碱水解后纸电泳分离单核苷酸,见BSMV-XJ-RNA和TMV-RNA同样含有m~7G~*p,而CpMV-RNA则无,证实BSMV-XJ-RNA在5＇-末端具有m7G帽子结构,同时对BSMV的蛋白外壳在弱碱条件下剥落的时间,条件及标记方法进行了研究。     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框     

mRNA 5′端二级结构的预测法

研究mRNA 5′端二级结构有什么重要性呢?下面的例子可以说明这个问题:如果在接近剪接位点的编码序列内有二级结构, 就会影响基因的转录;在引物中有二级结构(如发夹)就会抑制PCR反应;如果在合成的基因序列的5′末端有二级结构会干扰它在表达系统的翻译, 降低基因表达产物的产量, 这不仅提高了生产成本, 还给生产工艺等带来极大麻烦.此外, RNA5′末端形成二级结构所需要的能量也影响基因产物的产量.所以, 要想在基因表达系统中得到大量的基因产物就必须考虑这些问题, 并对所克隆基因5′末端的结构和它形成二级结构所需要的自由能进行分析, 并在此基础上对氨基酸的简并密码子进行选择, 以获取最满意的结果.可见, 这是一个在理论上和实践上都有重要意义的问题.在基因工程产品的开发过程中, 对这些问题的认识与运用具有不可估量的经济价值.     

利用5′-RACE法扩增到钙通道基因的5′-端片段

钙除了是人体牙和骨中的重要组成成份之外,吠”还是细胞内的第二信使。电压激活的钙离子通道在调节细胞内钙离子水平中有至关重要的作用。作者曾报道过用丁一RAC法克隆到钙通道基因3’一端3000多hp的大片段［1］,最近利用已知序列提供的信息,设计基因特异性引物,利用RT－PCR及5’－RACE法,我们又克隆到了此钙通道基因的丁一端约4．skb的大片段。1材料与方法1．亚总RNAN取用含10％／J‘牛血清的MEM培养基培养INS一1细胞。该细胞为鼠源胰腺9一细胞建株细胞（美国UniverstyofSouhAlabama的MingLi博士惠赠）,LVA钙通道基因高…     

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

 一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .     

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .     

猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67~ 1与-97~-59区段。在5′UTR转录调控区(-428~ 507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。     

高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备

利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性。研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒（H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp）,H5N1Pp的感染力滴度为1E8 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台。     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5′端截短片段的表达及增效活性测定

将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白 (HaGVenhancin)基因的重组表达载体 pET 30a En分别用BalⅠ和DraⅠ酶切后连接 ,构建重组表达载体pET 30a Ben和 pET 30a Den ,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因 5′端的 1 7kb和 2 2kb。IPTG诱导表达产生 66 7kD和 85 1kD的多肽并命名为Ben和Den。初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒 (HaNPV)及Bt的增效活性。Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效 1 0 5%～2 6 5% ,LT50 缩短 0 9d ,Den增效 1 0 2 %～ 33 0 % ,LT50 缩短 1 2d～ 1 9d。重组增效蛋白可对Bt(1∶2 50 0稀释 )增效 2 0 7%～ 35 4% ,Den增效 1 6 7%～ 31 5% ,Ben增效 1 1 7%～2 7 4%。这为进一步研制抗虫工程菌打下了良好的基础     

猪血清白蛋白基因5′-端调控区的克隆与分析

根据已报道的hsa(人血清白蛋白基因)启动子的序列设计了一对引物,以猪的基因组DNA为模板,采用PCR扩增出一条256 bp的DNA链,用Primer Premier5.0和Promoter ScanⅡ软件进行分析。结果表明,此序列为psa基因5′-端上游调控区,该区域含有一般启动子的CAAT-box、TATA-box等基本的顺式作用元件。另外,还含有CTF/NF-1,CTF,APF,HNF-1, CP1等转录因子的结合位点。     

我国大蒜潜隐病毒的基因组结构及3′端序列的变异

从我国6个省市12个大蒜样品上共检出10个不同的香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)分离物, 测定了浙江分离物ZJ1的基因组全序列和其他9个分离物的基因组3′端序列. ZJ1分离物RNA基因组全长8363个核苷酸, 3′端具polyA尾, 含6个可读 框(ORF), 分别编码复制酶, TGB1, TGB2, TGB3, CP和NABP, 基因组结构和其他Carlavirus属成员相似. 序列分析表明, 10个分离物均为大蒜潜隐病毒(GarLV), 不同分离物TGB2, TGB3和NABP的差异大于CP的差异, 且这些分离物和葱潜隐病毒(ShLV)也具有很高的同源性. 系统进化树分析表明, 大蒜来源的GarLV分离物可以分成4个类群, 我国分离物分别属于4个不同类群.     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

 为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

小麦丛矮病毒基因组5′端尾随区的克隆及序列分析

根据已知的弹状病毒聚合酶Ｌ蛋白分子中一段高保守的８个氨基酸顺序ＥＧＬＲＱＫＧＷ,合成简并的２４核苷酸引物,用锚定ＰＣＲ方法从小麦丛矮病毒（ＷＲＳＶ）基因组中扩增出包含全长５′尾随（ｔｒａｉｌｅｒ）区和部分Ｌ蛋白基因的ＤＮＡ片段,并克隆到ｐＵＣ１９Ｔ载体上,经测序,获得全长的ＷＲＳＶ基因组５′尾随区顺序。     

用S1核酸酶作图法测定蓖麻蚕18S rRNA基因的5′端位置

测定基因5′端位置是研究基因转录调控的一个重要前提。本文将蓖麻蚕18S rRNA基因DNA的5′端用~(32)P标记,然后与18S rRNA杂交,再用S1核酸酶水解掉非杂交区的DNA和RNA。分析放射自显影的结果,测出18S rRNA基因5′端的位置。在18S rRNA基因的BglⅡ_2位点向EcoRⅠ,方向延伸约220bp处,从这一结果,可知道蓖麻蚕rRNA基因的转录方向是5′EcoRⅠ_2→BglⅡ_23′。     

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2的cDNA克隆及5′端序列分析

分离了大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆株基因组的3个RNA组份。以RNA2为模板,3′端互补寡核苷酸为引物,合成了第一条cDNA链和第二条cDNA链,将ds-cDNA重组在pUC9质粒中,转化大肠杆菌细胞,获得含RNA3′端的克隆,并证明所选克隆的cDNA含有新疆株几近全长的RNA2组份。对于插入片段为3.3kbp的112号克隆进行了酶谱分析,得到了与国外典型株类似的结果;用双脱氧终止法分析了相当于RNA 2 5′端250bp的cDNA酶切片段,表明与国外典型株有十分相似的一级结构。     

依赖于5′端非编码区高级结构的真核生物mRNA翻译调控

翻译水平的调控是真核基因表达调控的重要环节.近年来的研究表明,许多真核基因的翻译依赖于RNA5′端非编码区的结构元件.一些小结构元件,如铁离子反应元件,具有1个茎环结构,由铁离子介导控制转铁蛋白的翻译.核糖开关通过结合特定代谢分子在2种结构状态下切换,调控可变剪接和翻译起始.另1个高度结构化的mRNA元件是内部核糖体进入位点,通过富集核糖体和起始因子促进基因的表达.本文综述了依赖于小结构元件、内部核糖体进入位点和核糖开关的真核基因翻译起始调控相应的研究成果和研究方法.对于研究的前景以及可能存在的挑战也作出阐述.