3′-poly(A)~-病毒RNA的大分子cDNA的合成和克隆

为了合成3′端无poly(A)的病毒RNA(登革热病毒Ⅱ)的3′区的长的cDNA,我们用RNA连接酶,把3′端被pCp封闭了的poly(A)<50bp连在病毒RNA的3′端,构成一个病毒RNA-poly(A)-pCp型模板,可用oligo(dT_(10-12))作引物,再用Watson和Jackson(1985)的RNase H代替硷降解法来合成cDNA。结果获得了≥5kb的cDNA。重组克隆的鉴定证明这个大分子cDNA确是病毒RNA 3′区的拷贝。这将有利于对这类RNA病毒基因组的结构-功能分析和对病毒cDNA拷贝的感染性的研究。     

大麦条纹花叶病毒新疆株RNA5′-末端帽子结构的鉴定

在弱碱条件下一些RNA病毒蛋白外壳可以特异性地从RNA5＇-末端开始剥落,对大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA以含帽子结构的TMV-RNA和不含帽子结构的CpMV-RNA为正,负对照,在弱碱条件下剥壳,用合成的pCp特异性地标记RNA5＇-末端帽子结构上的3＇-羟基,经碱水解后纸电泳分离单核苷酸,见BSMV-XJ-RNA和TMV-RNA同样含有m~7G~*p,而CpMV-RNA则无,证实BSMV-XJ-RNA在5＇-末端具有m7G帽子结构,同时对BSMV的蛋白外壳在弱碱条件下剥落的时间,条件及标记方法进行了研究。     

2′-5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅱ.pppA~(2′)p~(5′)A~(2′)p~(5′)A~(3′)p~(5′)Cp的合成及生物活性的观察

本文研究了以T_4RNA连接酶为工具,合成pppA2p~(5′)A~(2′)p~(5′)A~(3′)p~(5′)Cp(2′-5′P_3A_3-Cp)的条件,建立了分离产物的方法,连接得率可达83.1%,获得了紫外水平的量。初步研究了它的一些性质。2′-5′P_3A_3-Cp的分子结构与2′-5′P_3A_3不同,但在体外它也能抑制蛋白质的生物合成,有抗病毒等生物作用,它激活巨噬细胞的能力比2′-5′P_3A_3强。说明将pCp加到2′-5′P_3A_3的3′末端对其生物活性并无大的影响。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

长叶车前花叶病毒(HRV_(sh))外壳蛋白赖氨酸残基的修饰

我们曾报道长叶车前花叶病毒上海分离株(简称HRVsh)的外壳蛋白有二个赖氨酸残基,在PH8.5无变性剂存在的条件下,完整病毒颗粒表面的赖氨酸残基可与三硝基苯磺酸(TNPS)起反应,反应后的TNP-HRVsh病毒颗粒的感染力丧失达90％以上。 本文又进行了甲基乙亚胺甲酯(MEI)对HRVsh赖氨酸残基的修饰反应,修饰后的MEI-HRVsh病毒颗粒的感染力也同样丧失90％以上。 从三硝基苯磺酸修饰的病毒颗粒(TNP-HRVsh)中分离得到的RNA能与天然的HRVsh的外壳蛋白重建病毒颗粒,并具有感染力,说明修饰过程中核酸并不受影响。 进一步用同位素~(35)S,~(32)P双标记病毒,再以TNPS修饰标记的病毒,得到(~(35)S,~(32)P)-HRVsh及TNP-(~(35)S,~(32)P)-HRVsh。将两者分别接种于系统寄主青菜(Brassica chinensis)的一片叶片,一天后在非接种叶片上都可测得~(35)S,~(32)P的放射计数。其中,(~(35)S,~(32)P)-HRVsh的~(35)S/~(32)P比值降低了,而TNP-(~(35)S,~(32)P)-HRVsh的~(35)S/~(32)P比值保持不变。说明HRVsh外壳蛋白赖氨酸残基的修饰并不影响病毒颗粒进入寄主细胞,以及在寄主细胞间的转移。同位素双标记的结果表明,其感染力丧失的原因可能是由于上述修饰作用阻止了病毒在感染中所必须的脱壳过程。     

狂犬病病毒糖蛋白基因遗传变异研究进展

狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种不分节段的单股负链RNA病毒,属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)。狂犬病病毒属基因组长约12 000个核苷酸(nt),从3′端到5′端编码5个结构蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白     

Sabin2型脊髓灰质炎病毒适应人胚肺二倍体细胞不同代次病毒滴度与5′端非编码区变异关系

脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)是一类无包膜单股正链RNA病毒,基因组长约7．5kb。其5′端非编码区由约742个核苷酸长,主要与病毒RNA复制、蛋白翻译起始、病毒颗粒的装配及病毒的细胞适应减毒及神经毒力密切相关。我们研究发现,脊髓灰质炎病毒(Sabin株)在人胚肺二倍体细胞(KME17)上致细胞病变较猴肾细胞慢,病毒产量亦明显低于恒河猴肾细胞培养,国内外也有类似的报道。     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端(36～45)CP~(m~1)IpψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的合成

本文报道利用T_4 RNA连接酶酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端(36～45)Cp~(m~1)Ip-ψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的工作。合成制备时,我们采用将Cp~(m~1)IpψpG、GpG、ApGpApGp三片段从5′向3′延伸的合成路线。在合成路线的探索中我们发现了一些新现象:1.在T_4 RNA连接酶催化反应中Cp~(m~1)Ipψ作为受体有局限性。2.GpG等二核苷一磷酸可以与pCp等供体分子连接。3.60℃预温育对GpG片段的标记和六核苷酸、十核苷酸连接反应提高产率有明显的作用。     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(NPV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(EoPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16％的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31．5kDa和28．8kDa的衣壳蛋白，后者的含量是前者的2、5倍。3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾，编码RNA聚合酶(RdRp)，含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序，同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(PnPV)亲缘关系最近。这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒。     

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。     

与TMV-RNA装配起始位点互补的cDNA片段对TMV体外装配的抑制

合成了与TMV-RNA病毒装配起始位点互补的、长度为二十个核苷酸的DNA片段。该片段用~(32)P标记后,代替反义RNA(antisense RNA)与TMV-RNA进行硝基纤维素膜点杂交和溶液杂交。结果表明,该cDNA片段在两种条件下均能与TMV-RNA进行杂交。将溶液杂交的RNA-cDNA复合体经酒精沉淀,再与TMV衣壳蛋白的20S聚合体制剂进行体外装配,用测定310nm吸收光谱变化和电子显微镜观察的方法鉴定装配结果。实验证明,该cDNA片段与TMV-RNA杂交后抑制了装配起始位点的活力,从而使TMV病毒颗粒的装配不能完成。这一结果提示,TMV基因装配起始位点顺宁的cDNA和反义RNA能够在体外抑制TMV病毒颗粒的装配。     

高等植物中外源基因表达的转录后调控

转基因植物是研究高等植物中基因表达调控的重要手段和对象,高等真核生物中基因表达的灵活性多样性与转录后调控密切相关。本文着重阐述RNA的自身结构与代谢调控之间的关系,分别从5′端帽子结构、先导序列、3′末端序列及poly(A)尾巴、内含子序列、不稳定序列,使用的密码子等六个方面说明RNA的特定结构对其稳定性及翻译活性的影响。     

口蹄疫病毒自身核酸片段对病毒样颗粒组装的促进作用

选取能够与口蹄疫病毒结构蛋白相互作用且有特殊结构的核酸片段5′非翻译区(5′UTR)和内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)作为支架,进行病毒样颗粒组装的研究。通过对组装产物进行粒径、表面电位、凝胶阻滞、核酸酶消化、尺寸排阻色谱、透射电镜、圆二色光谱等检测,结果表明,核酸片段5′UTR和IRES能与口蹄疫病毒样颗粒共组装并形成病毒样颗粒。通过统计学分析发现VLPs-5′UTR的75S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P0.001)和VLPs-IRES (P0.01),而VLPs-IRES的12S颗粒的组装效率显著高于单纯VLPs组(P0.000 1)和VLPs-5′UTR (P0.000 1),表明口蹄疫病毒自身核酸片段5′UTR更有利于口蹄疫病毒样颗粒的组装。该研究对促进口蹄疫病毒样颗粒组装提出了新的思路和优化策略,有助于病毒样颗粒疫苗的研发。     

RNA病毒翻译调控元件—内部核糖体进入位点(IRES)

真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5′端非翻译区（untranslated region,UTR）翻译调控的顺式作用元件——内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）.它 们能够在一些反式作用因子的辅助下,招募核糖体小亚基到病毒mRNA的翻译起始位点.前,依赖IRES元件翻译起始的RNA病毒在哺乳动物,无脊椎动物及植物中均有发现.因此,对RNA病毒IRES元件的深入研究,不仅有助于阐明相关疾病的发生机理,而且为工业应用和疾病治疗提供借鉴意义.本文对RNA病毒IRES元件发现、分类、结构与功能等作了综述.     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

从茶尺蠖中分离到一株微小RNA病毒

从核型多角体病毒(PV)感染致死的茶尺蠖幼虫尸体中分离到一株微小RNA病毒(oPV)透射电镜观察纯化的病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒.16%的SDS-PAGE显示它有两个分子量为31.5 kDa和28.8 kDa的衣壳蛋白,后者的含量是前者的2.5倍.3′端克隆序列分析表明EoPV基因组3′有poly(A)尾,编码RNA聚合酶(dRp)含有微小RNA病毒RNA聚合酶的八个保守基序,同源性分析表明它与榕透翅毒蛾微小RNA病毒(nPV)亲缘关系最近.这些特点表明该病毒为一株新的微小RNA病毒.     

小RNA病毒3'非编码区结构与功能的研究进展

小RNA病毒基因组的两侧分别为5′非编码区(UTR)和3′UTR。研究表明:5′/3′UTR能形成复杂的RNA结构,如颈-环结构、三叶草结构和假结体结构等,在病毒的复制或翻译过程中发挥重要调节作用。本文即对近10年来有关小RNA病毒3′UTR的结构与功能研究方面的进展情况进行综述。     

一种简单高效扩增人杯状病毒ORF2区RT-PCR方法的建立及其意义

人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),是单股正链RNA病毒,长约7·5 kb,其3′末端有poly(A)结构。它可分为两个属:诺如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)[1],根据病毒抗原性和核苷酸序列的多样性,目前将诺如病毒和札如病毒分别划分为三个遗传组(group),每一遗传组依据RNA多聚酶及衣壳蛋白区域序列的差异,可进一步划分为不同群或基因型(cluster or genotype)。病毒基因组包括3个开放读码框(open reading frame,ORF),5′端和3′端各有一个小的非编码区。ORF1编码非结构蛋白的前体聚蛋白,其中包括RNA…