HIV-1 gag与gp41基因片段的序列特征与亚型研究

本文对华北地区出入境39例HIV-1阳性样本(中国21例,非洲17例,东南亚1例)的gag和env两个基因片段进行了序列特征和亚型对比分析。发现了A、A1、A3、B、C、G亚型和重组亚型03_AB、01_AE、AG、02_AG、07_BC、08_BC、CD和06_CPX共14个亚型,其中重组亚型占57.2%(8/14)。表明HIV-1基因变异较快,亚型分布广泛,重组亚型有增多趋势。此外发现26.7%(8/30)的样本,其gag和env基因区亚型表现不一致。提示在研究HIV-1亚型中应综合gag和env两个基因区的序列特征进行亚型分析。     

HIV-1衣壳蛋白的结构研究进展及应用策略分析

人类免疫缺陷病毒(HIV)已在全球蔓延并且出现了耐药性,急需开发新的高效、低毒的抗艾滋病药物和新的治疗策略。衣壳蛋白(CA)在HIV病毒颗粒的组装、成熟过程中的作用举足轻重,其单体主要由N端区域(NTD)和C端区域(CTD)组成。近年来HIV衣壳蛋白的空间精细结构得到了解析。本文总结了HIV衣壳蛋白在X射线晶体衍射技术下的空间结构特征,分别介绍了CA的NTD-NTD、NTD-CTD和CTD-CTD界面处的结构特征。本文也分析了基于HIV CA结构的AIDS治疗方法,并结合Crispr/Cas9基因编辑技术阐述了以CA为靶点的AIDS治疗新策略。     

核酸定量检测试验应用于HIV-1感染实验室诊断的探讨

目的:探讨核酸定量检测在HIV-1感染实验室诊断中的应用。方法:选取145例第四代抗原/抗体联合诊断筛查试验为阳性反应的血浆样本,分别用Western印迹和HIV-1核酸定量方法进行检测,综合对比分析2种方法检测结果。结果:Western印迹检出阳性样本120例,不确定样本17例,阴性样本8例;HIV-1核酸定量试验检出结果大于检测限样本131例,其中包括12例Western印迹不确定样本、2例Western印迹阴性样本;有3例Western印迹阳性样本用HIV-1核酸定量检测试验未能检出。结论:核酸定量检测试验对于HIV-1感染阳性样本是一种有效的实验室诊断方法;对HIV-1核酸定量检测结果为"TND"的样本,建议加做Western印迹或结合其他补充试验结果进行综合诊断。     

Rev蛋白: 抗HIV-1感染的新靶点

病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulatorofvirionproteinexpression,Rev)是HIV-1转录过程中不可缺少的调控蛋白。Rev与病毒mRNA的Rev应答元件(revresponseelement,RRE)相互作用,加速mRNA向核外转运。Rev缺乏或者不能进入细胞核,未剪接和部分剪接的mRNA将在核内完全降解,导致HIV-1的复制被阻断。Rev在HIV-1复制周期中起着重要的反式调节作用,是寻找新作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的新靶点。该文介绍Rev介导的核质转运过程和Rev蛋白的相关抑制剂。     

抗HIV-1 p15(gag)IgY抗体的制备及活性检测

目的:制备具有高效价强特异性的抗HIV-1 p15(gag)鸡卵黄抗体(IgY),纯化并分析其免疫学活性。方法:用纯化的HIV-1 p15(gag)蛋白抗原免疫蛋鸡,用水稀释法对IgY抗体进行粗提取并结合乙醇沉淀和氯化钠盐析法纯化抗体,再通过SDS-PAGE、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的纯度、特异性及效价。结果:表达纯化的HIV-1 p15(gag)-GST融合蛋白分子量为45kDa,用于抗体检测的抗原。用纯化的His-P15蛋白作为免疫原免疫蛋鸡后,获得的卵黄抗体重链、轻链分子量分别为65kDa和25kDa。8倍体积水稀释卵黄,pH值5.1,20%冰乙醇及0.028mol/L盐溶液分离纯化,纯度可达96℅,每毫升卵黄液可得到的卵黄抗体为9.8mg。终浓度为18%～25%的冰乙醇纯化的抗体浓度高且稳定,同时具有较强的特异性和较高的效价。结论:用HIV-1p15(gag)蛋白免疫蛋鸡,可以获得高效价的特异性抗体IgY,为IgY抗体在HIV-1p15蛋白的研究奠定了实验基础。     

中国HIV-1 B亚型P55和嵌合的P55-V3病毒样颗粒候选疫苗免疫效果的研究

研究我国艾滋病病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）病毒样颗粒（ＶＬＰ）候选疫苗的免疫原性,为疫苗进行灵长类实验提供实验依据。将ｇａｇ和ｇａｇ－Ｖ３ ＶＬＰ不同剂量（５０μｇ、１０μｇ、１μｇ）在有佐剂（氢氧化铝）和无佐剂条件下皮下免疫小鼠,然后眼眶采血,用ＥＬＩＳＡ法观察免疫鼠血清中抗体与剂量关系,以及中和抗体滴度和抗体ＩｇＧ亚型ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平。同时取鼠脾淋巴细胞,体外抗原刺激后收取淋巴细胞分泌上清     

用蛋白印迹确认实验检查"人类免疫缺陷病毒抗体不确定"结果的分析

目的 探讨蛋白印迹实验(WB)“人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体不确定”结果的特点、产生的原因、WB确认实验存在的问题及可能的改善措施。方法 归纳分析本实验室2004～2005年的WB检测结果为“HIV抗体不确定”者的人群分布特点、实验检测特点、受检者随访复检及抗体转归情况。结果 “HIV抗体不确定”者人员构成中相对健康的自愿咨询检测者、献血员以及孕产妇占50%,“HIV抗体不确定”者随访困难、复检率较低;WB实验存在假阳性、尤以P24带较为严重。结论 “HIV抗体不确定”结果与WB实验的假阳性有关,实验室应采取应对措施尽可能减少“HIV抗体不确定”及对结果进行准确解释。     

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a 载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni 金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。     

HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1 B’/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His.Tag、Trx.Tag及S.Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B’/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B’/C亚型Rev蛋白的表达。     

检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用

准确测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的技术,在感染者预后和艾滋病患者药物治疗效果的评价以及艾滋病的其它研究方面,都具有十分重要的应用价值。以定量的HIV-1DNA和RNA为标准外参照,利用SYBRGreen荧光染料和GeneAmp5700 Sequence Detection System(5700系统),建立了测定HIV-1的前病毒载量和病毒载量的荧光实时定量PCR技术。以病毒感染细胞和培养上清为材料,测定了三种化合物(AZT,GL和WT)对细胞内的前病毒载量和培养上清中的病毒载量的抑制活性,并与合胞体形成抑制方法测定化合物抗病毒活性的结果进行了比较。根据病毒载量、前病毒载量和合胞体形成计算出的三种化合物的治疗指数均依次变小,提出以荧光实时定量PCR技术测定前病毒载量,会在评价药物在体内外根除或减少存在于CD4休止或记忆T淋巴细胞中的HIV-1前病毒方面有特别的价值。     

SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答

研究SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV-1核酸疫苗的新策略。将pCIneoGAG联合SDF1基因或者pCIneoGAG单独免疫Balb/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFNγ水平,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖,用乳酸脱氢酶(LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答。研究结果提示:与pCIneoGAG免疫组比较,pCIneoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低,有显著性差异(p<0.01);而与pCIneoGAG免疫组比较,pCIneoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的IFNγ升高,差异显著(p<0.01);pCIneoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCIneoGAG免疫组,有显著性差异(p<0.01)。因此,SDF-1基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,SDF-1基因对体液免疫有抑制作用。SDF-1基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗是具有较好应用前景的免疫佐剂。     

SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答

研究SDF-1基因对HIV-1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV-1核酸疫苗的新策略. 将pCI-neoGAG联合SDF-1基因或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ水平,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖,用乳酸脱氢酶(LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答.研究结果提示 与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低,有显著性差异(p<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠血清的IFN-γ升高,差异显著(p<0.01);pCI-neoGAG联合SDF-1基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组,有显著性差异(p<0.01).因此,SDF-1基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,SDF-1基因对体液免疫有抑制作用.SDF-1基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗是具有较好应用前景的免疫佐剂.     

一种转移非特异性蛋白带的染色方法

考马斯亮蓝是常用的聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳的染料,利用硝酸纤维素膜(NCF)对染料的吸附作用,将低浓度的考马斯亮蓝(0.025%)染色液直接对NCF上的转移蛋白带进行染色,经实验反复验证.它是一种较好的NCF上转移非特异性蛋白带的染色方法.     

2017至2022年太原市HIV抗体不确定及后续随访阳转样本WB条带及流行病学因素分析

摘要 目的：探究HIV抗体不确定及后续随访阳转样本的WB条带和流行病学特征。方法：对太原市范围内2017年至2022年监测到的790份HIV抗体不确定及71例后续随访阳性人员的WB条带和流行病学信息进行分析。结果：（1）HIV抗体不确定样本主要来自医院、血液中心和自愿咨询与检测（VCT）机构,占比84.47%;阳转样本主要来自医院和VCT,占88.73%;不确定人群中的性病门诊就诊者和VCT人群阳转率最高,分别为50%、25.49%。（2）不确定和阳转样本以20-40周岁人员为主,占53.8%;不确定人群中的20-30岁阳转率最高,占15.57%。（3）不确定样本在学历、性别方面无明显差异,但阳转样本男性占比远高于女性、高学历人群相对较高。（4）不确定样本以已婚、无高危行为、就业人群为主,阳转样本以具有未婚、离异、丧偶、阳性配偶、男男同性恋（MSM）、学生、无业或待业等特点人群为主。（5）不确定样本条带以P24和P17条带和带型为主,阳转样本条带以P24和P17为主,以含有P24和gP160条带的带型为主。结论：不确定样本中具有性病门诊就诊者、VCT、MSM、20-30岁、未婚、无业等流行病学因素和具有P24或gP160条带等特点的样本后续阳转可能性较大,应以上述人群为防控干预重点,重点加强具有上述特点不确定样本的个案跟踪和随访检测。     

蛋白质印迹技术升级版（WB 2.0）的概念与设想

蛋白质印迹技术(Western blot,WB)基于抗体的特异性了解蛋白质的表达特征.该技术已经成为生命科学基础与应用研究的最常用技术之一.但目前WB手工操作多、实验流程难规范、一般只能用于同一WB分析内不同样品中目标蛋白质丰度的定性或相对定量,难以在不同实验室间进行WB数据比较.本文简要回顾了WB发展的历程,提出了升级版蛋白质印迹(WB 2.0)的概念,介绍了包括数字化、标准化、自动化、微量化、通量化以及基于内参的归一化建立数据库等为核心内容的设想.展望了WB 2.0的应用前景,提出在WB 2.0技术大规模应用的基础上,逐步建立开放的蛋白质表达特征数据库,成为继基因组、转录组等数据库之后生命科学领域的又一支撑平台.     

在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白

将编码人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白(Gag)P24的大部分基因片段,插入大肠杆菌表达载体pEX31A中,获得的表达产物MS2-Gag融合蛋白占菌体总蛋白的20％左右。Western blot结果证明,这种表达产物能被艾滋病(AIDS)患者血清中的特异性抗体所识别。这是国内首次报道在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白。对表达的重组核心蛋白的意义及应用前景进行了讨论。     

小鼠新分泌蛋白基因mBolA1的克隆与鉴定

采用生物信息学工具预测与实验相结合的方法得到了一个新的小鼠分泌蛋白基因mBolA1。该基因定位于染色体3F2,cDNA全长为730bp,编码137个氨基酸的蛋白,该蛋白含有一个保守的BolA结构域,等电点为9.05。用RT-PCR方法从鼠的混合cDNA库中克隆到mBolA1。Western blot实验表明mBolA1能从瞬转的COS 7细胞中分泌到细胞培养液中。亚细胞定位显示mBolA1定位于细胞浆,且与高尔基体不共定位,提示它是个非经典分泌途径的分泌蛋白。RT PCR显示mBolA1在组织中广泛表达。它的具体功能有待进一步研究。     

细胞内抗体在HIV-1感染及爱滋病治疗中的应用

ＨＩＶ1是慢病毒亚家族的成员,是ＡＩＤＳ的病因。像其它逆转录病毒一样,ＨＩＶ1基因组包含ｐｏｌ(聚合酶)、ｅｎｖ(包膜)结构基因,也编码Ｒｅｖ(毒粒蛋白调节子)、Ｔａｔ(反式激活蛋白)等调节蛋白。抗ＨＩＶ1细胞内抗体由细胞合成并导向其结合靶ＨＩＶ1蛋白和发挥抑制功能的细胞隔室。这些内抗体主要瞄准病毒生命周期中必需的蛋白质。1.包膜糖蛋白(ｅｎｖｅｌｏｐｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ)ＨＩＶ1包膜糖蛋白是作为ｇｐ160前体合成的,并在高尔基复合体上分裂为成熟的ｇｐ120/41蛋白。ｇｐ120与ＣＤ4在细胞表面和细胞内的相互作用不仅对病…