ACC氧化酶和ACC合成酶反义RNA融合基因导入番茄和乙烯合成的抑制

从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11,以番茄成熟果实的RNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆番茄全长的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因片段。完成两个基因的克隆和测序后,将888bp的番茄ACC氧化酶基因和943bp的ACC合成酶基因片段串联,构成全长1837bp的融合基因。将该融合基因以反义的方向插入植物双元载体pYPX145中番茄果实表达特异启动子下游,获得ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因融合的植物双元载体pOSACC。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草SAR序列,利于转基因的稳定遗传。以番茄栽培品种合作903子叶和下胚轴为外植体,利用根癌农杆菌进行基因转化,通过200mg／L卡那霉素选择和GUS检测,获得了105株番茄GUS阳性植株,转基因番茄果实在当代表现明显耐贮特点。经过4代的耐贮和果实农艺性状的综合选择,获得了两个表现良好的株系DR-1和DR-2,两株系果实乙烯释放量显著下降,是未转基因材料的9．5％,番茄的贮存期在50天以上。     

甘蔗ACC氧化酶全长cDNA的克隆及序列分析

ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物ACC氧化酶基因序列设计特异引物,从甘蔗cDNA文库中克隆到一ACC氧化酶基因片段,命名为GZ-ACO,该基因长792bp,与甘蔗基因组文库中克隆的ACO基因片段仅18个碱基之差。根据该cDNA片段序列,设计两对末端扩增的特异引物,利用RACE-PCR技术,获得GZ-ACO片段的5′端和3′端序列。用VectorNTI7.0软件对三个序列进行拼接和分析,结果得到全长的甘蔗GZ-ACO氧化酶基因。GZ-ACOcDNA核苷酸序列长1307bp,具有一个972bp完整的读码框,启动子ATG位于126bp,终止子TAA位于1097bp,推导编码323个氨基酸。系统进化分析表明,GZ-ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有65%~86%的同源率,且与单子叶禾本科植物首先聚类,其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类,最后与双子叶植物聚类,与植物形态的系统进化结果一致。该基因已在DDBJ/EMBL/GenBank基因数据库注册,注册号为AY521566。     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

香蕉果实成熟相关基因ACO1启动子区的克隆及其功能初探

根据已报道的香蕉课实表达ACC氧化酶基因（ACO1）的序列,用改进的接头连接PCR法从香蕉基因组中扩增并克隆了此基因5′旁侧区1526bp的片段,其中包含一个推测的TATA盒序列;与已公布的两个香蕉ACC氧化酶基因启动子序列（分别为934bp和1451bp）的相似性各为97．3％（Lopez-Gomez等）和88．8％（May和Kipp)。将4个含有不同大小启动子区的克隆片段与GUS基因编码区连接构建成嵌合成基因,通过基因枪轰击转入香蕉叶、根和果实的细胞后,瞬时表达结果表明不同大小的ACO1启动子区段都只在果实细胞中指导GUS基因表达,证明该启动子具有指导基因在果实中表达的功能,并推测负责果实特异性的顺式元件可能位于启动子近端0．7kb区段之内,在468至822的355bp区段内可能在与正控制有关的顺式元件。     

香蕉果实成熟相关基因ACO1启动子区的克隆及其功能初探

根据已报道的香蕉果实表达ACC氧化酶基因(ACO1)的序列,用改进的接头连接PCR法从香蕉基因组中扩增并克隆了此基因5′旁侧区1526bp的片段。其中包含一个推测的TATA盒序列;与已公布的两个香蕉ACC氧化酶基因启动子序列(分别为934bp和1451bp)的相似性各为97.3%(López-Gómez等)和88.8%(May和Kipp)。将4个含有不同大小启动子区的克隆片段与GUS基因编码区连接构建成嵌合基因,通过基因枪轰击转入香蕉叶、根和果实的细胞后。瞬时表达结果表明不同大小的ACO1-启动子区段都只在果实细胞中指导GUS基因表达,证明该启动子具有指导基因在果实中表达的功能;并推测负责果实特异性的顺式元件可能位于启动子近端0.7kb区段之内,在468至822 的355bp区段内可能存在与正控制有关的顺式元件。     

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰(RNAi)研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段.以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW+crtY)融合基因片段YYT为间隔区,将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704.以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg/L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69%以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的.     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其反义植物表达载体的构建

以康乃馨（Dianthus caryophyllus L.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,CO)基因的序列设计产合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接pGEM^(R)-Teasy vector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp。共编码304个氨基酸残基,序列分析结果表明该序列与GenBankL35152中的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符,推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的,随 后将此片段反向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了一反义植物表达载体pBO;又把花特异表达启动子PchsA插入pBI121的HindⅢ Xbal位点构建中间载体pGHB,再把康乃馨ACC氧化酶基因反向插入中间载体pCHB的XbaI Satl位点构建成另一反义植物表达载体pCBO。     

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰（RNAi）研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT—PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段。以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW crtY)融合基因片段YYT为间隔区。将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704。以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg／L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽。荧光定量RT—PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91．69％以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。     

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

以亚洲百合Polyanna(Liliumspp.)花瓣为材料,根据已报道的百合ACC氧化酶基因片段设计1对末端扩增特异引物,采用RACE方法,获得百合ACC氧化酶基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU296623).该cDNA全长1 152 bp,具有一个954 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸.Blast搜索结果显示,百合ACC氧化酶基因核苷酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有71%~82%的相似性,氨基酸序列有70%~87%的相似性,聚类分析表明,与单子叶植物百合科郁金香首先聚类,其次与双子叶植物聚类,最后与单子叶禾本科和兰科植物聚类.     

番茄ACC合成酶cDNA克隆及其对果实成熟的反义抑制

利用RT—PcR技术克隆了ACC合成酶多基因家族成员之－LE-ACC2编码区约1．7kb的cDNA,经酶切图谱和序列分析鉴定无误后,反向插入到植物表达载体pBin437中,构建了表达Acc合成酶反望RNA的二元载体。经农杆菌途径转化番茄“丽春”品种后,通过PCR检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到6株转基因植株,Southern杂交确证了外源基因是以单拷贝插入到番茄染色体中;对果实乙烯释放的测定结果表明转基因番茄果实的乙烯释放量仅为对照的30％左右,在室温下转基因番茄果实采后保存60 d以上仍然没有变红、软化。以上结果表明其反义RNA在转基因番茄中的表达能有效地抑制乙烯的生物合成从而延缓果实成熟,表现出良好的耐储保鲜特性。对转基因植株子一代(T1)的分析结果进一步表明反义ACC合成酶基因以典型的单基因方式传到子代。通过对子二代的分析已初步筛选到一 个耐储藏的转基因番茄纯合品系。     

Different effects on ACC oxidase gene silencing triggered by RNA interference in transgenic tomato

RNA interference (RNAi) is a potent trigger for specific gene silencing of expression in a number of organisms and is an efficient way of shutting down gene expression. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) oxidase catalyzes the oxidation of ACC to ethylene, a plant growth regulator that plays an important role in the tomato ripening process. In this research, to produce double-stranded (ds)RNA of tomato ACC oxidase, we linked the sense and antisense configurations of DNA fragments with 1,002-bp or 7-nt artificially synthesized fragments, respectively, and then placed these under the control of a modified cauliflower mosaic virus 35S promoter. The dsRNA expression unit was successfully introduced into tomato cultivar Hezuo 906 by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Molecular analysis of 183 transgenic plants revealed that the dsRNA unit was integrated into the tomato genome. With respect to the construct with the 1,002-bp linker, the severity of phenotypes indicated that 72.3% of the transformed plants had non-RNA interference, about 18.1% had semi-RNA interference, and only 9.6% had full-RNA interference. However when the construct with the 7-nt linker was used for transformation, the results were 13.0%, 18.0%, and 69.0%, respectively, indicating that the short linker was more efficient in RNAi of transgenic tomato plants. When we applied this fast way of shutting down the ACC oxidase gene, transgenic tomato plants were produced that had fruit which released traces of ethylene and had a prolonged shelf life of more than 120 days. The RNA and protein analyses indicated that there was non-RNA interference, semi-RNA interference and full-RNA interference of ACC oxidase in the transgenic tomato plants.     

在转基因烟草中表达番茄反义ACC合酶基因及其对芽再生的影响

利用从番茄(Lycopersicum esculentum Mill.)果实中分离到的ACC合酶cDNA,反向置于CaMV 35S启动子的控制之下,并转入烟草(Nicotiana tabacum L.)。PCR扩增证明此反义基因已整合到烟草的基因组上。Northern杂交及逆转录PCR分析表明,这种异源反义基因能在转基因烟草组织中表达,并抑制了烟草内源乙烯的合成,对乙烯合成的抑制在芽再生过程中更为明显,同时这也导致了转基因烟草在组织培养过程中芽再生能力的增强。这些结果从基因水平证明,乙烯在芽形成过程中具有重要的调控功能。     

番茄ACC合酶反义基因对河套蜜瓜的转化

河套蜜瓜（CucumismeloLcvHetau）的子叶经预培养。芽诱导和生根培养,获得再生小植株,诱导率达58％。取带有番茄ACC合酶反义基因的双元载体pMQ6／JM109与农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404经三亲融合后,与在MS0上萌发5d、并在MS＋1mg／LNAA培养基上预培养3d的子叶共培养48h,然后转入含50mg／L卡那霉素的MS＋6mg／LZT的芽诱导培养基中,1l个月后诱导生芽,待芽长1．5－2cm时转入生根培养基中,1－2周后可诱导产生大量的根,形成完整的转基因小植株。经PCR和分子杂交检测证明,目的基因已整合入河套蜜瓜的基因组中。     

Transformation of Cucumis melo cv. Hetau with Tomato Antisense ACC Synthase Gene

An efficient in vitro plant regeneration system of Cucumis melo L. cv. Hetau was established. Regenerated plantlets were obtained from cotyledons after preculture, shoot inducing culture and root inducing culture. A high regeneration rate was achieved up to 58%. Cucumis melo was transformed with the antisense tomato ACC synthase gene in binary vector pMQ6 via Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer. Kanamycin resistant plantlets were obtained on MS medium with 6 mg/L zeatin, 50 mg/L kanamycin and 650 mg/L cefotaximine. PCR and molecular hybridization analysis showed that tomato ACC synthase antisense cDNA was integreted into the genome of C. melo.     

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

柿果实ACC合成酶cDNA的克隆及其序列分析

根据其它植物ACC合成酶（1－aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)氨基酸保守区,设计1组简并引物,用RT－PCR法,从柿（Diospyros kaki Thunb.)果实扩增出3个约1kb左右的cDNA片段,将其克隆至pGEM-T载体上,对这些重组克隆进行序列测定和氨基酸序列推导,DK－ACS1由1101个碱基组成,编码364个氨基酸;DK－ACS2是1086个碱基,编码359个氨基酸;DK－ACS3为1089个碱基,编码363个氨基酸。它们均具有其它植物ACS合成酶中存在的7个保守区和11个不变氨基酸残基,且在多肽水平上有较高的同源性。与番茄LE－ACS2的同源性DK－ACS1是60.5A%,DK-ACS2是70.7%,DK－ACS3为66．9％,与甜瓜CM－ACS1的同源性依次分别是60．4％,72．1％和64．4％。