重组质粒pHN32对花生根瘤菌固氮的影响

通过三亲本杂交将大豆根瘤菌高效基因工程菌株HN32所携带的增效重组质粒pHN32引入一株快生型花生根瘤菌菌株85-7和另一株慢生型花生根瘤菌菌株co2-5中。花生盆栽结瘤试验结果统计分析表明:p的HN32载体质粒pLAFR1对根瘤菌85-7和co2-5的固氮功能没有影响;pHN32对85-7固氮影响不论在植株干重方面还是在固氮酶活方面统计学上都不显著;而对co2-5则植株干重提高了25.7％,存在极显著差异,固氮酶活尽管提高了51.8％,但统计学上不显著。根瘤中分离的Tc~r根瘤co2-5(pHN32)中的pHN32EcoR1酶切分析表明:pHN32没有发生结构上的变化且固氮增强作用可能由3.7kb外源片段引起。     

慢生型大豆根瘤菌的结瘤基因转入快生型大豆根瘤菌中

通过三亲本杂交把慢生型大豆根瘤菌USDAllO的基因文库转移至Tn5诱变的不结瘤的快生型大豆根瘤菌321,338中,用链霉素和四环素平板选择大量接合子,接种大豆,通过结瘤基因功能互补,获得7个根瘤,从中分离出的每个菌株都仍具有链霉素和四环素抗性。分离其质粒,发现每个菌株都多了一条较载体质粒pLAFRl分子量大的质粒。将这些质粒转移至大肠杆菌HBl01中,分离其质粒,用32P标记的ncd探针进行DNA—DNA分子杂交,除载体质粒pLAFRl为阴性反应外,其他重组质粒均为阳性反应,即所获得pLAFRl克隆的DNA片段上确有nod结构基因。回收重组质粒pLAFRl：：nod,用限制性内切酶EcoR I进行酶切,从其琼脂糖凝胶电泳图上估计pLAFRl上克隆的DNA片段分子量为32kb。     

湖北地区快生型大豆根瘤菌的质粒及结瘤基因的初步定位

从湖北省潜江县和监利县的4个采集点分离纯化了26株快生型大豆根瘤菌。质粒分离分析结果表明:所测快生型大豆根瘤菌中均有1—3条质粒带,分子量范围在50—300 Md之间。从26株快生型大豆根瘤菌中,选出分属两个血清型的5个菌株,依据根瘤菌nodABC基因在所有根瘤菌种中的结构同源性,对快生型大豆根瘤菌的结瘤基因(nod)进行了初步定位,其结果表明:R173、X143、B21、B2,D13菌株的质粒DNA中没有与nod ABC基因同源的片段存在,而R173、X143、B21、D13菌株的总DNA中含有部分no     

几类快生型根瘤菌质粒的研究

用一种重现性好而较简便的方法,对国内的紫云英、豌豆、三叶草、大豆等快生型根瘤菌及根癌农杆菌共40多号菌进行了质粒分离,所得质粒图谱具有一定的菌株特异性。每株菌有1—3个质粒,其中至少有一个大质粒或巨大质粒。用质粒消除法获得失去结瘤(或致癌)能力的变异株,均缺少一个大质粒。快生型根瘤菌的结瘤基因定位在大质粒或巨大质粒上。用接合法将Rpl：：Tn501等质粒转入根瘤菌中,能诱动根瘤菌的结瘤基因转移给失去结瘤能力的变异株,可表达功能,质粒图谱也发生变化,与供体或受体都不同。     

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110总DNA作为探针,与快生型大豆根瘤菌杂交时,没有杂交斑点形成,而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点,表明该探针具有种和部分菌株特异性,用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交,检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力,发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70%～90%。     

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP501l及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizo-bium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68．45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japo—nicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0．3—0．5m01／L Nacl,其中有些菌株能产生黑色素。将9o株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿卜无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和菖蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。     

五株大豆根瘤菌噬菌体的普遍性转导

本文研究了5种烈性大豆根瘤菌噬菌体在大豆根瘤菌菌株间的普遍性转导。噬菌体psc和psx能在慢生大豆根瘤USDA110菌株间转导营养缺陷型标记和卡那霉素抗性标记。快生大豆根瘤菌MD3菌株间可通过噬菌体pfm转导营养缺陷标记和卡那霉素抗性标记。噬菌体pfc和pfx可在快生豇豆根瘤菌ANU240及其变种ANU265间转导抗性基因和定位于共生质粒（sym质粒）上的结瘤基因（common nod）。所有转导频率均在10-6~10-7之间。用紫外线处理噬菌体裂解液可以相应提高转导频率。     

苜蓿中华根瘤菌042B共同结瘤基因nodABC的克隆与序列分析*

根瘤菌的nodABC和nodD在结构和功能上保守,在不同的菌种之间能够互换〔1〕,是目前所有供试的豆科植物结瘤所必不可少的,称为共同结瘤基因。另一类是寄生专一性结瘤基因,如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的nodPQ等〔2〕,这些基因决定根瘤菌能与哪些种属豆科植物结瘤〔3〕。根瘤菌的结瘤呈寄主专一性,例如苜蓿中华根瘤菌的寄主范围很窄,仅能在苜蓿、草木樨和葫芦巴3个属的豆科植物结瘤〔4〕。但在1995年。本实验室从新疆苜蓿分离到一株菌株042B,既能在大豆又能在苜蓿上结瘤．而且在大豆上具有较高的共生效率〔5〕。本文拟克隆其nodABC,并与其他菌株nodABC序列进行比较,以阐明042B能在大豆和苜蓿结瘤的分子机制。     

快生型大豆根瘤菌和大豆品种不同土壤类型对结瘤的相互影响

胡济生教授和H.Keyser1982发表了从中国中部土壤中分离到快生型大豆根瘤菌。当时由于快生型大豆根瘤菌在美国栽培大豆上不结瘤,只能在中国北京黑豆上结瘤,因此,快生型大豆根瘤菌能否在栽培大豆上结瘤和大豆品种间的关系如何引起了人们的重视和研究。1983～1987年很多研究报导了在人工接种条件下快生型大豆根瘤菌能在某些栽培大豆     

慢生根瘤菌属结瘤基因的进化及遗传分析

根瘤菌中存在一系列控制固氮结瘤因子(lipo-chito-oligosaccharides)合成的结瘤基因(nodulation genes)。其中, nodA基因是合成结瘤因子所必需的, 该基因负责酰基转移酶的合成, 能将不饱和脂肪酸转移到结瘤因子寡聚糖骨架上; 基因nodZ, nolL和noeI为宿主专一性结瘤基因, 分别转录合成岩藻糖基转移酶, 岩藻糖乙酰化酶和岩藻糖甲基化酶。通过GenBank调取慢生根瘤菌属及其他根瘤菌属的结瘤基因nodA, nodZ, nolL和noeI, 构建系统发育树, 进行进化和遗传分析。结果表明, 慢生根瘤菌属各个菌株的nodA, nodZ, nolL和noeI具有很高的相关性, 但是与根据保守基因16S rDNA和dnaK分类情况不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的, 同时可能为适应宿主及环境条件, 结瘤基因有少量的平行转移。结果表明, 慢生根瘤菌属各个菌株的nodA, nodZ, nolL和noeI具有很高的同源性, 同时发现基于保守基因16S rDNA和dnaK对慢生根瘤菌的分类情况与慢生根瘤菌属各菌株在nodA, nodZ, nolL和noeI具有较高同源性的事实不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的, 同时可能为适应宿主及环境条件, 结瘤基因有少量的平行转移。     

磁场对大豆共生固氮的效应

恒定磁场处理慢生大豆根瘤菌“005”和接种后的大豆植株,发现磁场可以提高根瘤的固氮活性。在一定的磁场强度(70—100mT)下,固氮活性平均可以提高4—5倍,植株的结瘤数和根瘤重量平均提高2—3倍。从这样的根瘤中所分离出的根瘤菌,由慢生型转变成快生型,在100植株中有17株的根瘤分离出快生菌。生长世代时间和培养溶液中的pH值与慢生型不同,而与快生型相同。     

紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

大豆根瘤菌005菌株及其应用的研究

要获得固氮活性高,侵染力强、适应性广的根瘤菌株必须针对不同地区的环境条件和寄主品种进行选育。我国鲁西南以及黄淮地区夏大豆的种植面积很大,七十年代我所在大田广泛调查的基础上选育出大豆根瘤菌优良菌株005。现将其特性介绍如下: 005 菌株抗血清的专一性根瘤菌由于形态、生理、结瘤性相同,很难在同一接种族进行再分类。然而根瘤菌细胞表面携带抗原,不同菌株抗原结构不同,用血清学的方法进一步在同一接种族再分类鉴定。1923年Sterens首先     

豇豆根瘤菌NGR234和紫云英根瘤菌109感染紫云英的比较研究

利用光学和电子显微镜对紫云英根瘤菌菌株109和广宿主的快生型根瘤菌菌株NGR234感染温带型豆科植物紫云英进行了研究,结果表明根瘤菌感染紫云英是通过在根毛中形成侵染线的途径。电子显微镜研究揭示了固氮根瘤中细胞内侵染线的存在。接种二天后,首先可观察到根毛的卷曲或分枝。接种四至五天后,在每株植物卷曲的根毛中可看到侵染线。接种八至十天后的植株出现肉眼可见的根瘤。菌株NGR234能够在紫云英上诱导根毛的卷曲,侵染线和根瘤的形成,但所形成的根瘤却未能固氮,根瘤中无明显的类菌体区,但有少数包有细菌的侵染线。NGR234抗抗菌素的衍生菌均未能使紫云英结瘤。将NGR234的共生质粒转移至三叶草、苜蓿、豌豆、快生型大豆根瘤菌和农杆菌,亦未能使这些细菌获得紫云英上结瘤的能力。     

耐盐高效大豆根瘤菌株的构建

快生型大豆根瘤菌RT19是一株耐盐而固氮能力差的菌株,在含有0．3 mol／L Nacl的YM培养液中生长良好,代时为3．5h,甚至在0．6mol／L NaCl条件下仍可生长。慢生型大豆根瘤菌USDA110对盐敏感,在含有0.1 mol／L Nacl的YM培养液中不生长,但结瘤固氮能力强。     

普通结瘤基因探针鉴定根瘤菌的研究

普通结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）是所有根瘤菌所特有的、最为保守的基因,用苜蓿根瘤菌结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）和豌豆根瘤菌的（ｎｏｄＣ）基因片段为探钉,与５２株包括常见土壤细菌、已知根瘤菌、根瘤未知分离物的总ＤＮＡ进行斑点杂交,探索用普通结瘤基因（ｎｏｄＡＢＣ）或（ｎｏｄＣ）探针鉴定根瘤菌的可能性。结果,未找到合适实验条件,使来自这两个种的结瘤基因只能与根瘤菌菌株杂交,而不与土壤细菌的菌株杂交。但在高温条件下,两种探针都专一性的和种内菌株杂交。此结果表明：在一定的实验条件下,普通结瘤基因探针用做根瘤菌的鉴定,只能     

应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测

含发光酶基因luxAB的Tn5转座子自杀质粒pHNC3,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入快生型大豆根瘤菌HN01中小,pHNC3经自杀重组,其Tn5－luxAB转座插入HN01基因组中,从而赋予HN01以发光活性。挑取具有发光活性的HN01杂交单菌落,进行质粒快检和以luxAB为探针的分子杂交,选取Tn5-luxAB分别插入到HN01染色体上和不同质粒上的标记菌株,进行灭菌盆栽实验,并对一株Tn5-luxAB标记于染色体上的菌株HN01LC02进行了模拟大豆栽培条件下的有菌盆栽实验,包括对发光根瘤菌占瘤率的测定和发光根瘤在根系上分布情况的测定。     

一株能在苜蓿上结瘤的费氏中华根瘤菌

费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii) 0 4 2BS分离自新疆的苜蓿根瘤 ,通过交叉结瘤试验 ,发现它既可在苜蓿上又可在大豆上结瘤固氮。 1 6SrDNAPCR RFLP分析表明 ,0 4 2BS与费氏中华根瘤菌模式菌株USDA2 0 5的 4种限制性酶切图谱完全一致。其G +Cmol%为 60 0 ,与费氏中华根瘤菌USDA2 0 5和USDA1 91的DNA同源性分别为 84 9%和89 6% ,表明 0 4 2BS属于费氏中华根瘤菌。应用绿色荧光蛋白基因标记 0 4 2BS ,得到重组菌株 0 4 2BSG。将其接种保定苜蓿和北引 1号大豆 ,并重新分离出根瘤菌 ,利用激光共聚焦荧光显微镜检测到标记基因的表达 ,从而确证了 0 4 2BS能在苜蓿和大豆上结瘤。而且 ,0 4 2BS对不同苜蓿品种的结瘤能力不同     

旋扭山绿豆快生型根瘤菌不结瘤突变株的分离

旋扭山绿豆快生型根瘤菌D1202菌株在吖啶橙(20ug/ml,30μg/ml)的作用下(28℃培养7天),可以诱发不结瘤Nod~-突变株。从单菌落结瘤试验表明,Nod~-突变个体占群体数的10—20%。随机挑取的未经吖啶橙处理的20个单菌落的回接试验,旋扭山绿豆植物能正常地结瘤固氮。说明控制结瘤作用的基因对吖啶橙处理敏感。     

转座子Tn5-Mob对菜豆根瘤菌共生基因的诱变、转移和初步定位

转座子Tn5-Mob在质粒RP4-4配合下能诱动(Mobilization)菜豆根瘤菌RCR3622内源质粒的诱动转移。在种间根瘤菌杂交过程中,二个巨型质粒的转移频率均大于10~(-3);分子量约为285kb的psym3622是带有结瘤(nod)和产黑素(mel)基因的共生质粒(Symbiotic plasmid);这二个基因的最大距离不超过70kb左右。另一个分子量约为135kb的质粒在试验中为不具结瘤功能的隐蔽质粒。将psym3622共生质粒导入不结瘤(Nod-)的豌豆根瘤菌菌株B151,能够使后者在菜豆植物上表达结瘤的特性,形成无效根瘤。将psym3622共生质粒导入不结瘤的菜豆根瘤菌菌株JI8400,能够在菜豆植物上形成正常发育的有效根瘤。