三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅲ.三尖杉酯碱抑制作用动力学及其衍生物作用的比较

本文报告了三尖杉酯碱抑制艾氏腹水癌细胞DNA聚合酶α的动力学。三尖杉酯碱的抑制作用与反应体系中的模板DNA量有关,过量的DNA可降低药物的抑制作用,但不能完全消除药物的抑制。并证明三尖杉酯碱与模板DNA对DNA聚合酶α是混合型抑制,当三尖杉酯碱浓度为10μM时,其K_i值为9.5μM,K_m值为13μg DNA/100μl。三尖杉酯碱抑制DNA聚合酶α的能力不受反应体系中四种脱氧核苷三磷酸底物浓度的影响,通过同时改变四种底物浓度,或固定三种底物浓度只改变其中一种底物的量,或采用限制性DNA合成系统(Limited DNA Synthesis)即在完全体系中省略去某一底物,均证明三尖杉酯碱与四种底物对DNA聚合酶α为非竞争性抑制,当三尖杉酯碱浓度为4μM时,对dCTP、dGTP和dTTP的K_i值分别为12μM、11μM和12μM。本文也比较了三尖杉酯碱衍生物——高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和表三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的抑制作用。结果表明,当药物浓度相同时,高三尖杉酯碱的作用较三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱强,而三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱的作用相近;表三尖杉酯碱本身对DNA聚合酶α无抑制作用,也未见其在无细胞系统中对三尖杉酯碱的抑制能力有加强作用。以上药物对E.coli DNA聚合酶Ⅰ也有相似的抑制作用。     

微量直接法检测鸭乙型肝炎病毒DNA多聚酶

鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA多聚酶(DNAP)是研究DHBV感染规律和观察药效的敏感指标,但常规方法测定DNAP需用较多量血清并超速离心,不适用于大批标本的检测。本文参照Sprengel介绍的掺入液条件,用微量血清(70～100μl)直接检测鸭血清中的DHBV-DNAP,比常规超速离心法和DHBV-DNA斑点杂交法简便。同时,观察了膦羧基甲酸钠(PFNa_3)对DNAP的抑制作用,以探讨方法的特异性和可行性。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究 Ⅱ.三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的影响

本文报告了三尖杉酯碱对艾氏腹水癌和小鼠L_(1210)白血病细胞DNA聚合酶α的抑制作用。癌细胞破碎后,经超速离心,DEAE-纤维素和磷酸纤维素P_(11)柱层析部分纯化了DNA聚合酶α。该酶在1μM三尖杉酯碱存在时的抑制率为40%左右。在一定的三尖杉酯碱浓度范围内,酶的抑制率随药物浓度的增加而升高。经药物预保温的DNA,模板活性没有变化;而经药物预保温的酶,其活性受到了显著的抑制。当酶量或模板量固定不变时,则过量的模板或过量的酶均能降低药物的抑制率。上述结果初步表明三尖杉酯碱可能是酶的竞争性抑制剂。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅱ.三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的影响

本文报告了三尖杉酯碱对艾氏腹水癌和小鼠L_(1210)白血病细胞DNA 聚合酶α的抑制作用。癌细胞破碎后,经超速离心,DEAE-纤维素和磷酸纤维素P_(11)柱层析部分纯化了DNA 聚合酶α。该酶在1μM 三尖杉酯碱存在时的抑制率为40%左右。在一定的三尖杉酯碱浓度范围内,酶的抑制率随药物浓度的增加而升高。经药物预保温的DNA,模板活性没有变化;而经药物预保温的酶,其活性受到了显著的抑制。当酶量或模板量固定不变时,则过量的模板或过量的酶均能降低药物的抑制率。上述结果初步表明三尖杉酯碱可能是酶的竞争性抑制剂。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

叶绿体中果糖-1,6-双磷酯酶(FDP-酶)的研究 Ⅰ.菠菜叶绿体中FDP-酶的提纯与某些动力学特性

分离的 FDP-酶在 pH 8—9下催化活性最高,而在 pH6下可在几个月内保持其活性。电泳的结果表明提纯后的酶只有一个区带。比较存在于低渗涨破的叶绿体中的 FDP-酶与提纯的 FDP-酶,初步结果说明这两种状态下的酶在动力学特性上有明显差异。虽然它们的活性都与 Mg~( )浓度有关,但涨破叶绿体中的 FDP-酶对 Mg~( )的 Km 较小。Mg~( )浓度明显限制着此酶的活性。EDTA 对其活性也有抑制作用。EDTA 对提纯的 FDP-酶与涨破叶绿体中的 FDP-酶的抑制效应不同,15μmoleEDTA 可完全抑制前者的活性,但30—45μmole EDTA 只能抑制后者活性的70%。用0.2% Triton X-100处理叶绿体,对其中的 FDP-酶有增活效应。这说明 FDP-酶的活性与叶绿体中的层膜可能有关。     

几种药物抑制马传染性贫血病毒和人免疫缺陷病毒的实验研究

用马传染性贫血病毒—驴胚肺二倍体细胞(EIAV-DELDC)为实验体系,以细胞中病毒逆转录酶活性及病毒相关抗原的表达为观察指标,检测了叠氮胸苷(AZT)、三氮唑核苷(Ribavirin,病毒唑)、磷羧基甲酸钠(PFA)和苏拉明等4种已知抗人免疫缺陷病毒(HIV-1)药物对马传染性贫血病毒的抑制作用。结果表明,PFA、AZTTP(三磷酸AZT)和苏拉明均能抑制病毒相关抗原的表达,AZT虽无此作用,但能抑制细胞内逆转录酶活性。用~3H-TMP掺入法比较了PFA、AZTTP、苏拉明对体外无细胞系EIAV逆转录酶粗提物和HIV-1基因工程产物逆转录酶活性的抑制作用表明,两种逆转录酶对苏拉明的敏感性相近,而HIV-1逆转录酶对PFA和AZTTP的敏感性较EIAV者高约100倍。又以无细胞系中逆转录酶活性测定法,检测了12种中药提取物的抑制作用,其中小柴胡汤对EIAV和HIV-1逆转录酶活性都有抑制作用,IC_(50)为717μg/ml和700μg/ml(生药浓度)。小柴胡汤对两种病毒感染细胞中抗原的表达和HIV引起细胞病变都有抑制作用,对HIV-1的抑制比EIAV强。这些结果表明,EIAV-DELDC体系可考虑作为抗HIV-1药物筛选模型。     

优化反应体系提升Phanta DNA聚合酶对非处理标本的检测性能

在食品检测、法医鉴定、分子诊断等领域经常需要对未提纯DNA的非规范处理标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。然而,由于非处理标本中存在多种抑制成分,常见的DNA聚合酶并不能满足非处理标本的检测需求。本研究通过调节添加剂、Mg~(2+)浓度以及酶量,对Phanta DNA聚合酶进行反应条件优化,提升Phanta DNA聚合酶突变体的扩增性能,并考察该聚合酶在优化条件下对血液、植物和食品等非处理标本的检测性能。结果表明:在反应缓冲溶液SF Buffer中加入质量分数5%二甲基亚砜(DMSO)和3 mmol/L Mg~(2+),以及50μL反应体系中使用1U酶时,Phanta DNA聚合酶突变体具有最强的扩增性能,可对低至0.05 ng基因组、植物叶片粗提液、高达40%全血浓度及食品粗提液进行有效检测,性能优于普通Taq DNA聚合酶及未进行反应条件优化的Phanta DNA聚合酶。本研究在食品检测、法医鉴定、分子诊断等应用中非处理标本的检测具有极大应用价值。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究——Ⅱ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶B的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素、磷酸纤维素和DEAE-Sephadex层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶B,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈二条有聚合酶B活力的区带。其中不含有DNase、RNase和蛋白酶活力,无内源DNA。50μg/ml的α-鹅膏蕈碱抑制聚合酶活力达90％以上。最适(NH_4)_2SO_4浓度为40mM。最适Mn~(2 )浓度为2mM。Mg~(2 )对酶B无激活作用。变性DNA对酶B较天然DNA有更高的效率。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究I．酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B一12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含Dnase、Rnas：和蛋白酶活力,无内源．DNA。测定了RNA聚合酶A和c对弘鹅膏蕈碱的敏感性。酶A在a-鹅膏荤碱为400μg／ml时,活性受到抑制,而酶c在该浓度时,几乎不受抑制。(NH4)zSO4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40raM和240raM。无二价金属离子Mn+或Mg2+,酶A和c几乎无活力。两种酶最适Mn2+浓度均为2.5mM,Mg2+浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。