高通量检测大样本桑黄发酵液总黄酮含量方法的建立

建立了大样本的桑黄发酵液样品中总黄酮的高通量测定方法。通过L9(34)正交实验设计优化,确定了基于亚硝酸钠-硝酸铝比色法的微孔板检测方法,优化后总黄酮含量测定的最佳反应条件:5%亚硝酸钠30μL,10%硝酸铝30μL,10%氢氧化钠50μL,室温反应10 min,检测波长为510 nm。检测结果表明,针对大样本检测,该法稳定性高,平均回收率为100.7%,相对标准偏差为0.607%,线性范围为0~50μg/m L,线性相关系数r2=0.9994。比较分析结果显示,和多种传统总黄酮测定方法相比,实验所建立的高通量测定方法检测大样本快速、准确、用药量小,且稳定性高。     

迎春花植物茎叶中黄酮类物质初步研究

采用硝酸铝——亚硝酸钠比色法对迎春花茎叶内的黄酮类物质含量进行了初步测定,确定了总黄酮含量提取的适宜溶剂浓度和提取的适宜时间。结果表明,用60％甲醇溶剂提取5h总黄酮含量最高,茎杆中的含量为10．42mg/g DW,叶片中的含量为18．31mg／g DW。此外,还对迎春花叶提取液进行了各种黄酮定性颜色反应,初步确定其中的黄酮类物质主要为双氢黄酮类及查尔酮类。     

荧光定量PCR检测人巨细胞病毒的方法学建立

目的建立人巨细胞病毒（HCMV）的TaqMan MGB探针荧光定量PCR（FQ—PCR）检测方法。方法选取HCMV MIE exon4为PCR扩增靶序列,经TA克隆构建重组质粒作为定量标准品,经FQ—PCR反应条件的优化及方法学评价,再将其应用于临床检测。结果FQ—PCR最适循环参数为：95℃ 5 min;95℃ 20 s,60℃ 60 s（40 cycles）,20μl最适反应体系为：2．0mmol／L Mg^2＋、0．5μmol／L引物、1．5μmol／L探针、200μmol／L dNTP、2110×buffer、1．0 U Taq酶、2．0μl DNA模板。检测批内CV（变异系数）值为1．32％,批间CV值为1．96％;特异性较好;线性范围为10^2-10^8copies／μl。结论成功地建立了检测HCMV的FQ—PCR法,完全适用于临床检测。     

木豆叶总黄酮测定方法的比较研究

采用比色法测定木豆叶中的总黄酮含量。对三氯化铝比色法、硼酸—柠檬酸比色法和硝酸铝比色法3种测定方法进行比较,确定了硝酸铝比色法为木豆叶总黄酮的最佳测定方法,该方法稳定性、精密度和重现性好,其RSD分别为2.1%、0.9%和2.3%,应用该方法测定木豆叶总黄酮含量为15.65 mg·g^-1 DW。本方法适用于木豆叶或其制剂中总黄酮的质量分析检验,为木豆叶中黄酮的研究开发提供了质控依据。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

泥胡菜中芦丁含量分析

建立高效液相色谱法测定泥胡菜中芦丁的方法,优化芦丁的提取工艺。使用Diamonsil（TM）C18柱,流动相：乙腈-0．4％磷酸溶液（20：80）,检测波长：255nm,流速：1ml／min,柱温：30℃。样品用50％乙醇超声提取30min提取率最高为0．166％;芦丁在0．1～2．0μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0．9994）,平均加样回收率99．3％（RSD=0．8％,n=5）。该方法准确、快速、重现性好,可作为控制泥胡菜质量的有效测定方法。     

拳卷地钱中黄酮类化合物的含量测定

本文建立了拳卷地钱中黄酮类化合物的含量测定方法。采用改进的铝盐显色分光光度法测定拳卷地钱总黄酮含量;采用反相高效液相色谱法测定拳卷地钱黄酮类化合物中芹菜素、槲皮素和木犀草素的含量。分光光度法表明：总黄酮含量在1．6～16μg/mL范围内,线性关系良好,加标回收率在97．61～101．59％,相对标准偏差0．16％;反相高效液相色谱法表明平均加标回收率96．79～101．13％,相对标准偏差0．66～1．52％。本方法用于拳卷地钱中黄酮类化合物含量的测定准确可靠,结果令人满意。     

亚麻SRAP反应体系的优化

通过研究亚麻SRAP反应体系中主要因子对扩增结果的影响,建立了亚麻SRAP-PCR反应的优化体系.在20μL的反应体系中将PCR的5个主要成分分别设定8个浓度梯度,结果表明,最适宜的优化浓度分别为:1.5 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1.5 U Tap酶、30 ng/μL模板DNA 90 ng和25 ng/μL引物100 ng.用6个亚麻材料验证优化体系,检测结果显示,多态性高,反应体系的稳定性和可重复性好,为SRAP标记技术在亚麻分子生物学研究方面的应用奠定了基础.     

散斑壳属真菌RAPD-PCR反应条件的优化

以分离自四川省二郎山林场云南松上的松针散斑壳菌(Lophodermium pinastri)为材料,提取其总基因组DNA做为RAPD-PCR体系优化的模板。研究了dNTPs、Mg~(2+)、DNA模板、Taq酶、引物等组分对RAPD反应结果的影响,并建立了最佳反应体系:25μL PCR反应体积,10×Taq酶缓冲液2．5μL,1．5 U Taq酶,20 ng DNA模板,0．4 mmol/L dNTPs,4．0 mmol/L Mg~(2+),0．48μmol/L引物,10．2μL ddH_2O。     

西伯利亚蝗基因组DNA提取及RAPD分析条件的优化

以西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus(L.)为研究材料,利用改良的SDS法提取高质量的DNA,分别测试了dNTP浓度、镁离子浓度、TaqDNA聚合酶用量、模板DNA的量等因素对反应结果的影响。通过各因子的组合比较,建立了西伯利亚蝗RAPD优化体系:25μLPCR反应体系,10×buffer2·5μL;dNTP0·24mmol/L;MgCl22·0mmol/L;Taq DNA聚合酶1U;DNA模板45ng;引物30ng。扩增程序为:94℃预变性1min45s、94℃变性30s、35℃退火1min30s、72℃延伸2min,45个循环、72℃延伸10min。结果表明,利用优化的反应条件进行西伯利亚蝗基因组DNA分析,实验有着良好的重复性和稳定性。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

百里香属植物ISSR—PCR和SRAP—PCR体系的确立及优化

通过对PCR扩增体系中的模板DNA用量,Mg^2＋、dNTPs和引物浓度的单因子实验,分别建立了适合百里香属（Thymus L．）植物总DNA的ISSR—PCR及SRAP—PCR优化反应体系。ISSR—PCR优化反应体系为：反应总体积20μL,含模板DNA 30ng、Mg^2＋3．75mmol·L^-1、dNTPs 0．20mmol·L^-1、引物0．3mmol·L^-1和TaqDNA聚合酶1U。SRAP—PCR优化反应体系为：反应总体积20μL,含模板DNA30ng、Mg^2＋2．50mmol·L^-1、dNTPs 0．10mmol·L^-1、引物0．4mmol·L^-1和Taq DNA聚合酶1U。运用优化的反应体系对百里香属植物地椒（T.quinquecostatus Celak．）、地椒的亚洲变种[T.quinquecostatus vat．asiaticus（Kitagawa）C．Y．Wu et Y．C．Huang]和百里香（T.mongolicus Ronn．）15个居群的总DNA进行了ISSR和SRAP初步分析,获得了较好的扩增结果。     

益智ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：获得适合的益智ISSR-PCR扩增反应体系。方法：利用正交设计L46（4^5）和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素（Taq酶,Mg^2＋,模板DNA．dNTPs,引物）在4个水平上进行优化试验,将二者所得结果进行综合比较分析。结果：最终扶得益智ISSR-PCR反应的最优体系（20μl）为：模板DNA 100ng,Mg^2＋ 3．0mmol／L,引物0．8μmol／L,dNTPs0．25mmol／L,Taq DNA聚合酶1．0U。最后,对益智ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为50℃。结论：这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。     

气相色谱法测定二高γ-亚麻酸

本文建立了一种测定二高γ-亚麻酸气相色谱方法,色谱条件为L=300mm长的毛细管柱,柱温230℃,FID检测器。样品的线性范围为10-30μg,精密度和重现性的RSD分别为1．45％和1．15％,回收率为98．96％,RSD为1．47％。     

莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(N.lutea)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究.获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10 μL反应体系:模板DNA浓度为50 ng、1μL10×Buffer、MgCl2浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U、正反向引物浓度均为0.8μmol/L.为检测该优化体系的稳定性,进一步选取16对引物组合对88份花莲核心种质进行PCR扩增,获得了183条清晰的谱带,其中165条具有多态性,比率为90％,说明建立的莲SRAP反应体系是稳定可靠的.莲SRAP-PCR反应体系的优化和建立,为利用SRAP标记技术深入开展莲的遗传多样性评价、遗传连锁图构建和分子辅助育种等研究提供成熟的技术体系支撑.     

高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量

建立高效液相色谱法测定甜菊糖苷中甜菊醇的含量。色谱条件:色谱柱为Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为乙腈-水(50∶50);流速1.0 mL/min;检测波长213 nm;柱温30℃;进样量10μL。线性范围为1.046μg/mL~52.3μg/mL(r=0.9997),加标平均回收率为96.60%,RSD为0.51%(n=6)。本方法准确度高、精密度高、重复性好、简捷易操作,可以作为甜菊糖苷中甜菊醇含量的测定方法。     

血清岩藻糖测定方法学研究

本文对血清岩藻糖测定方法进行了系统研究。血清用量由200μL减至50μL,显色反应4h内稳定。吸收峰在396nm。岩藻糖浓度40μg/mL内线性良好,批间CV=2.1％。以Sephadex-G200层析,血清岩藻糖主要存在于分子量为500kD的组分中。以本法测得30例健康人血清岩藻糖浓度为588.1±172.0μmol/L。     

珍稀植物杨叶肖槿ISSR体系建立及检测

针对珍稀植物杨叶肖槿ISSR反应的特点,建立了适用于杨叶肖槿遗传多样性研究的ISSR最适反应体系,具体包括:2.0μL 10×Buffer,27.5ng的模板DNA,2.0μL的dNTP,1U的Pyrobest DNA酶,1.25μmol/L的引物;最佳反应程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,49℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。应用该优化的反应体系筛选出了10条稳定性强、清晰度高而且表现出一定多态性的ISSR引物,并对杨叶肖槿进行了检测,获得了清晰稳定的扩增图谱。     

南方碱蓬根茎叶总黄酮提取与含量测定

以不同浓度的酒精、料液比、提取温度及提取时间等条件,对南方碱蓬根、茎、叶总黄酮提取进行正交设计实验,并用聚酰胺吸附-硝酸铝显色法测定其总黄酮含量。结果表明,总黄酮的优化提取条件,根为50倍原料重的45%乙醇溶液在80℃条件下提取30 min,含量为(1.50±0.20)%;茎为30倍原料重的60%乙醇溶液在80℃条件下提取50 min,含量(0.94±0.24)%;叶为30倍原料重的75%乙醇溶液在80℃条件下提取30 min,含量为(6.35±0.45)%。