用改良的酸酚法制备高纯度质粒DNA

制备纯净的具有生物学活性的质粒DNA 是基因工程研究中一个重要基础。     

用酚-氯仿直接从克隆中提取质粒DNA

目的:对用酚-氯仿直接从克隆中提取质粒DNA的方法进行了研究。方法:采用不同次数的酚-氯仿抽提,在不同RNaseA作用温度及作用时间下提取了三种质粒。结果:用酚-氯仿抽提2次,RNase A45℃作用8min,质粒纯度(OD260/OD280)为1.85左右、产量大于0.8μg/克隆。结论:本法不但快速,且所提质粒均能满足后续实验如酶切鉴定、测序等方面的需要。对于大批量重组克隆的筛选尤为适合。     

分离纯化质粒DNA方法的比较

质粒的研究在遗传工程上占有重要地位。其分离纯化是一项费工费时和得率甚微的工作。一般常用的方法有制备性电泳,平衡等密度超离心和速度区带超离心等,这些方法各有特点,作者对它们进行了比较。质粒DDNA从苏芸金杆菌(Bacillus thuri-ngiensis)变种 isvaelensis 4Q_2-22和变种     

快速鉴定和大量纯化质粒DNA的方法

为了快速鉴定重组质粒DNA, Birnboim等 人^[1]建立了快速碱性抽提法。在此基础上,我 们作了某些修改,不仅较有效地防止了质粒 DNA变性形式的出现,而且可以用来大量抽提 质粒DNA。若再协同轻基磷灰石柱层析121和酸 酚法^[6]处理,可获得纯度较高的质粒DNA。我 们用修改法提取了分子量从2.6X10^[6]-26X10^[6] 道尔顿的4种不同质粒DNA,均收到了比较理 想的结果,特别对于难于抽提的或大质粒DNA 更为有效。     

大肠杆菌pFD7质粒DNA的分离纯化及分子特性的研究

我们研究了PFD7质粒DNA的抗变能力及其纯化方法。经试验,pFD7质粒DNA在100℃处理2—4分钟可保持85％以上的转化活性,处理10分钟转化活性降到50％以下,处理20分钟仅剩10％左右,而在pH12.5处理3—5分钟,转化活性没有下降。 经琼脂糖凝胶电泳鉴定,经上述热或碱处理后pFD7质粒DNA电泳带不变,而染色体DNA在100℃处理2分钟或pH12.5处理3—5分钟即发生变性并显著降解,原电泳带消失。从pFD7质粒DNA分别对热和碱的稳定性可推知它主要以CC-DNA形态存在。     

大肠杆菌cosmid质粒的分离和DNA构型

Bolivar等u]于1977年用人工重组技术从ColEl质粒构建出声pBR322质粒,由于pBR322质粒带有两个抗药性标记,有多拷贝以及多种限制性内切酶单一切点等特性,近年来已被广泛用作重组DNA实验的载体。Collins等^[2]用pBR3222质粒与λ charon 4A的带有Cos位点的EcoRI酶切片段重组,进一步得到cosmid质粒,cosmid质拉除了具有pBR322质粒原来的优点外,它能够携带更大的外源DNA片段(40Kb),能够像λ charon 4A一样在体外进行包装,从而提高转化率。     

琼脂糖凝胶电泳分离纯化和制备质粒DNA

分离纯化质粒DNA,在遗传工程和质粒的 分子遗传学研究中是重要的一环。分离和制备 质粒DNA的方法很多,有：澳化乙锭密度梯度 祛^[2-5]、两相法^[6]、酸酚法^[7][碱变性法^[8]p、甲基化 白蛋白（MAK）柱层析法^[9]硝酸纤维素法^[10]、电 泳法^[11]等,这些方法都各有所长。根据质粒的超 卷曲结构、开环结构和线状结构的不同,各个质 粒分子量大小的不同,以及质粒DNA与RNA 和染色体DNA在电泳中迁移率的不同,在我 们实验室的条件下,研制了一种琼脂糖凝胶电 泳分离纯化和制备质粒DNA装置。运用这种 装置,纯化制备了以下质粒： pBR322, pASI, pUB110、F}lac+proA+B+, pVA517A, pVA517B, pVA517C, pVA517D, pVA517E, pVA517F, pVA517G和pVA517H。并且对它们进行了电 镜观察,对其中纯化过的pBR322和pASI质粒 进行了转化实验,证明它们有生物活性。同时, 应用这种装置,可以一次分离具有不同分子量 大小的几种质粒,回收率约为85多。结果表明, 这种装置结构简单,操作方便,是纯化制备质粒 DNA的一种可用工具。     

一种有效纯化低拷贝质粒DNA的改良硅藻土法

碱法制备的低拷贝质粒因含有大量杂质而无法获得有效的测序结果。为此,以纯λDNA为样品,对硅藻土纯化DNA的方法进行了优化,表明硅藻土悬液的最佳用量是20μl／μgλDNA,回收率达77．31％。应用此改良硅藻土法纯化一长为14953bp的低拷贝质粒pLZ14,所得质粒纯度达23．87％,比未纯化前提高了11．06倍。经纯化的pLZ14质粒测序信号强、无误认碱基,而未经纯化的质粒测序时信号弱、错误普遍存在。     

用琼脂糖凝胶制备电泳— 冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展，DNA 做 为一种实验材料要求纯化方法更加简便，质量 更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许 多报道fs-5I。国外多采用氯化艳密度梯度离心 法，国内则限于条件，很少应用此法。我们建 立了琼脂糖制备电泳— 冻融法，以纯化质粒 DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行，而 且效果良好。     

用琼脂糖凝胶制备电泳——冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展,DNA做为一种实验材料要求纯化方法更加简便,质量更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许多报道。国外多采用氯化铯密度梯度离心法,国内则限于条件,很少应用此法。我们建立了琼脂糖制备电泳——冻融法,以纯化质粒DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行,而且效果良好。     

用超滤法从猪血中分离纯化猪血红蛋白

为了给人工红细胞的研究提供较高纯度和浓度的血红蛋白,采用超滤膜分离的方法,通过研究分析,在一定超滤条件,从新鲜猪血中分离纯化得到猪血红蛋白。并应用SDS-PAGE凝胶电泳、紫外-可见分光光度计对纯化后的血红蛋白进行了鉴定分析。经分析,优化的超滤条件为:操作压力0.05Mpa、料液温度12℃;在此条件下分离纯化的猪血红蛋白,纯度达到了99%以上,浓度较纯化前提高了近20倍。     

电泳洗脱法纯化共价闭环质粒DNA

质粒DNA的分离纯化通常采用传统的氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法,此法结果理想,但耗钱多,费时长,不是目前我国一般实验室所能常用的。而琼脂糖凝胶电泳不仅能将分子量不同的DNA区分,还能区分共价闭环     

电泳洗脱法纯化共价闭环质粒DNA

质粒DNA的分离纯化通常采用传统的氯 化艳-溪化乙锭密度梯度离心法⁴⁾,此法结果理 想,但耗钱多,费时长,不是目前我国一般实验 室所能常用的。而琼脂糖凝胶电泳不仅能将分 子量不同的DNA区分,还能区分共价闭环 (ccc) DNA和开环（(oc) DNA³⁾,并在此基础上 建立了从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的 方法。但在回收过程中容易造成cccDNA出现 缺刻(nick）而转变为ocDNA⁸⁾.     

碱裂解法提取细菌质粒DNA的改良

碱裂解法是目前最为广泛应用的细菌质粒DNA的提取方法。但该法提取DNA所需时间较长,通常需要2h以上。为了快速提取质粒DNA,对常规碱裂法中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNA酶A及无水乙醇的反应时间由原来的5min,5min,10min,30min,10min分别缩短至5s,1min,5s,10min,5min。这种改良方法极大地缩短了DNA的提取时间,可在30min内完成整个DNA的制备,且制备的DNA可直接应用于进一步的酶切,连接及PCR等各种分子生物学分析。     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCRl 和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA 重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

用凝胶电泳纯化具有生物学活性的质粒DNA

采用一般柱电泳装置,在琼脂糖凝胶上将质粒ColEl、pBR322、pSC101、pCRI的DNA与染色体DNA及小分子核酸杂质分开,切出含有质粒的凝胶薄片,电洗脱回收质粒DNA,产物可被限制酶Eco RI酶解;将pBR 322、PSC 101、pCRI DNA转化大肠杆菌C_(600),每微克DNA可产生10~4个转化子;从pSC 101、pCRI转化子细胞中再抽提出相应质粒,它们同样具有亲本质粒的遗传特性和分子特性。     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCR1和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

一种改良的质粒DNA小量提取法

对碱裂质粒小量法进行了改进,并且在提取过程中增加了ＬｉＣｌ处理。实验证明这种方法结果稳定,提取的质粒ＤＮＡ产量高、质量好,符合大多数分子生物学常规实验的要求。     

简单快速分离无RNA的大肠杆菌质粒DNA的方法

本文介绍一种简单快速分离质粒ＤＮＡ方法。此方法有两个主要步骤。用这种方法分离的质粒ＤＮＡ纯度高、无ＲＮＡ,并可用于酶切、连接等操作。     

用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星DNA标记

将花生(Arachis hypogaea L．)基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再进行克隆和测序,根据SSR两端的保守序列设计引物,经过多态性分析后,便可得到微卫星DNA标记。整个实验过程操作简单、消耗少,可在一周内完成,可作为从植物中分离SSR的一种简单有效的方法。