龙眼顶芽转录组简单重复序列(SSR)标记信息分析及分子标记开发

随着新一代测序技术的发展,大量的转录组数据和表达序列标签(EST)成为开发简单重复序列(SSR)标记的可利用资源。本研究利用MISA软件筛选龙眼(Dimocarpus longan)顶芽转录组数据库序列,从114 445条龙眼转录组unigene序列中发现11 546个SSR位点,SSR出现频率为10.09%。其中1 975条unigene含有两个或两个以上EST-SSR位点,占所有SSR位点的比例为17.10%,SSR出现的平均距离为7.52 kb。从龙眼转录组SSR核苷酸基序类型来看,二核苷酸(52.11%)和三核苷酸(46.15%)出现频率最高,占所有核苷酸出现频率的99.26%。在龙眼转录组SSR中二核苷酸重复基元出现频率最高的是AG/CT(4 250个,占36.81%),三核苷酸重复基元出现频率最高的是AAG/CTT(1 109个,占9.61%)。对含SSR位点的9 571条unigene序列进行引物设计,共设计出了8 347对SSR位点特异引物。随机挑选合成50对EST-SSR引物,以‘石硖’、‘储良’、‘古山2号’、‘立冬本’等四份龙眼材料的基因组DNA为模板对这批引物进行PCR扩增、筛选,结果表明,其中21对引物能产生理想的PCR产物,有效扩增率为42%;16对引物扩增条带具有多态性,占有效引物的76.2%;16对多态性引物共扩增获得50个条带,其中多态性片段21个,每对引物平均产生1.31个多态性片段。     

基于高通量测序的文冠果转录组分析

应用Illumina Hi-seqTM2000高通量测序技术对文冠果花芽进行转录组分析。共获得N50为1 180bp、平均长度为686bp的unigene 58 311条。与公共数据库Nr和Swiss-Prot同源性比较后发现37 047条unigene获得基因注释,另有21 264条unigene未被注释。利用COG数据库将unigene分成25类。通过GO分类和KEGG Pathway富集性分析,将unigene分别归类于55个GO term和128个代谢途径。此外,在9 794条unigene中共搜索到12 213个SSR位点,单核苷酸重复基元出现频率最高(34.95%),其次分别为二核苷酸(32.74%)和三核苷酸(28.64%)。在获得的unigene中发掘出涉及4个开花调控途径(光周期途径、春化途径、GA途径和自主途径)多个基因的同源序列。研究结果可在一定程度上解析文冠果花芽形态分化的分子调控模式与机制。     

李白盾蚧转录组分析及SSR位点开发

李白盾蚧Pseudaulacaspis prunicola (Maskell)寄主范围广泛,是一种重要的入侵害虫。本研究利用高通量测序平台（Illumina NovaSeq 6000）对李白盾蚧进行转录组测序、de novo从头组装及功能注释,在此基础上筛选其微卫星（SSR）位点,并挖掘微卫星引物。研究共获得李白盾蚧转录组60 296条转录本,24 967条单基因（unigenes）序列。通过GO数据库注释,将所有unigenes的功能分为生物学进程、细胞组分和分子功能三大类41个亚类功能区。KOG数据库注释结果显示,5 085条unigenes归到25个基因家族,注释到一般功能预测的数目最多。KEGG代谢通路富集分析显示6 668条unigenes注释到280个代谢通路,其中注释到内质网中蛋白质加工的数目最多。利用MISA软件共搜索到微卫星位点18 193个,分布在9 043条unigenes中,占总unigenes数量的36.22%,平均每2.29 kb出现一个SSR位点。其中主要重复类型为单核苷酸重复,占SSR位点总数的72.03%,其次为三核苷酸重复（15.90%）和二核苷酸重复（8.48%）。单核苷酸重复主要为A/T（71.16%）,二核苷酸重复主要为AG/CT（5.20%）。基于Primer Primer 3软件设计出12 538对李白盾蚧SSR引物,从中随机挑选50对引物进行PCR验证,共29对引物可以稳定扩增出目的片段。本研究成功组装了李白盾蚧转录组数据,并基于转录组数据成功筛选出其微卫星位点,为未来该虫的种群遗传学以及入侵生物学研究提供了数据支撑。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

不同大小规格墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)转录组分析及生长相关基因筛选

墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)是中国双壳贝类养殖的重要经济品种,具有较高的研究价值,然而,转录组学及基因组学信息的匮乏,严重制约了该贝的遗传改良进程。本研究基于Illumina Hi SeqTM2000平台,对5月龄大规格(平均体质量16.05 g)和小规格(平均体质量5.57 g)墨西哥湾扇贝进行转录组测序,经de nove组装,大、小规格墨西哥湾扇贝分别获得120 563和118 794条高质量unigenes,unigene的平均长度分别为944 bp和969 bp;按照FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1的原则,共筛选出9 901个差异表达基因,其中,大规格组相对于小规格组,上调基因4 976个(50.26%),下调基因4 925个(49.74%);六大公共数据库Blast比对结果显示,差异表达基因在Nr数据库的注释率最高,其次是GO数据库;从已获功能注释的差异表达基因中筛选得到47个生长相关候选基因,涉及多个生长因子及其受体;GO功能富集结果显示,膜、L-氨基酸运输和糖基键水解酶活性分别是细胞组分、生物过程和分子功能富集unigene最多的条目;Pathway富集分析发现,3 699条差异表达基因被成功注释到252条代谢通路中,其中33条为显著性富集通路(p<0.05),富集度最高的是焦点粘附;大规格组中共鉴定出10 870个SSRs和242 551个SNPs,小规格组中共鉴定出10 857个SSRs和228 121个SNPs。研究结果为墨西哥湾扇贝分子标记批量开发、功能相关基因挖掘以及分子遗传育种提供了理论数据支撑。     

基于高通量测序的怒江红山茶微卫星位点特征分析

以怒江红山茶叶片为材料,采用Illumina Hiseq 2000平台测序,共获得140 996条无冗余的序列,进行SSR位点搜索后,得到32 696个SSR位点,出现频率为23.2%。所搜索的SSR以二核苷酸重复类型最多,三核苷酸和单核苷酸次之,四、五、六核苷酸重复类型较少（<1%）。单核苷酸重复类型中以A/T基元较丰富（10.92%）;二核苷酸中AG/CT基元出现频率最大,达到49.72%,AT/AT基元和AC/GT基元所占比例相差不多,而CG/CG基元所占比例最少,为0.07%;三核苷酸重复类型中AAG/CTT最多,ACC/GGT、ATC/ATG和AGG/CCT基元次之,CCG/GGC、ACT/AGT和ACG/CGT基元较低,都小于1%;四、五、六核苷酸类型中各重复基元均较少。在怒江红山茶转录组中,微卫星的数量随着对应的重复类型、重复次数的增加而降低,也随重复区段碱基长度的增加而降低。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

山地虎耳草和棒腺虎耳草转录组SSR和SNP分析

利用Illumina HiSeqTM2000对山地虎耳草和棒腺虎耳草进行转录组测序,分析和比较其SSR和SNP特征。结果表明:山地虎耳草63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00kb出现一个SSR位点;棒腺虎耳草60 972条Unigene序列中含有4 542个SSR,发生频率为7.45%,有85种重复基元,平均每10.40kb出现一个SSR位点,略低于山地虎耳草。山地虎耳草和棒腺虎耳草转录组序列的SSR优势基元均为三核苷酸重复。2个物种的转录组SSR以5~10次的较低重复次数为主,长度主要集中于12~30bp,具有较高的多态性。山地虎耳草和棒腺虎耳草中分别获得118 424个和112 006个SNP位点,编码区的SNP位点分别占30.40%和28.59%,且在编码SNP中同义突变所占比例(30.27%、28.48%)远高于非同义突变(0.13%、0.11%)。比较发现,2个物种的各项检索结果基本一致,推测与选取的组织部位、组织的发育阶段以及物种的亲缘关系有关。     

基于转录组数据的杜仲红叶性状SSR分子标记分析

对‘华仲12号’杜仲的幼嫩叶片（绿色）和成熟叶片（红色）及‘华仲11号’杜仲成熟叶片（绿色）进行转录组测序,进行测序数据的拼接和组装,且对转录组获得的基因（Unigenes）进行SSR分析。研究得到54 517条平均长度为806.90 bp的Unigenes,其中25 993条Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白数据库获得功能注释,占所有Unigenes的47.68%。参照KEGG数据库,可将注释到的6 910条Unigenes划分到122个代谢途径分支,其中花色苷代谢途径相关酶基因39个,类黄酮代谢途径38个,类胡萝卜素合成途径34个。54 517条Unigenes中共包含17 010个完整型SSR位点,占总SSR位点的96.28%。完整型SSR位点共包含67种重复基元,其中出现频率最高的重复基元类型为单核苷酸重复中的A/T （7 747个）,其次是AG/CT （5 039个）和AT/AT （850个）从花色苷代谢途径、类黄酮代谢途径及类胡萝卜素代谢途径中共找到13个SSR位点。为今后杜仲遗传多样性分析、遗传图谱构建及杜仲红叶性状分子标记开发等方面奠定了分子基础。     

甘薯EST资源的SSR信息分析

从NCBI公共数据库下载获得22371条甘薯EST序列,去除低质量的和冗余的序列后,得到总长为5．09×10^3kb的9204条唯一序列。从这些序列中搜索到总共436个SSR位点,平均相距11．68kb出现一个SSR。这些SSR的出现频率和平均长度分别为4．4％和24．28bp。在2-6bp的重复基元中,六核苷酸重复基元出现频率最（30．96％）,其次是三核苷酸重复基元（29．59％）和二核苷酸重复基元（24．54％）。出现最多的重复基元是AG／CT（16．28％）,其次是AAG／CTT（11．01％）。     

两种黄连转录组中SSR位点信息分析与多态性引物开发

本研究通过对两种黄连,即黄连(Coptis chinensis Franch.)和云南黄连(C.teeta Wall.)转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记提供理论基础。利用MISA工具筛选黄连及云南黄连转录组测序获得的55 903和49 741条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取60对引物对两种黄连,每种20株,共40株进行多态性扩增分析。黄连和云南黄连转录组分别搜索到4 071和4 041个SSR位点。两种黄连中二核苷酸和三核苷酸重复皆是主要的类型,分别占总SSR的87.71%和87.58%。黄连中,二核苷酸重复基元出现最多的为AG/CT,共953个,占总SSR的23.40%,三核苷酸重复基元出现最多的为AAG/CTT,共746个,占总SSR的18.3%;在云黄连中,AG/CT和AAG/CTT分别为934(23.10%)和773(19.10%)。随机选取60对引物进行PCR扩增,其中12对(20.00%)表现出多态性差异。利用Populations软件作图,将40个材料分为2类。两种黄连转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

基于转录组数据的意大利蝗微卫星位点分析与分子标记开发

【目的】意大利蝗Calliptamus italicus (L.)是新疆荒漠半荒漠草原重要害虫。本研究利用已获得的意大利蝗转录组数据,鉴定其微卫星位点。【方法】使用MISA筛选SSR位点,利用Primer Premier 5设计引物,通过PCR扩增对引物进行验证。【结果】在意大利蝗转录组数据库中,共检测出156500个SSR位点,分布在126369条unigene中。其中,单核苷酸重复为60.88%,二核苷酸重复为23.58%,三核苷酸重复和四核苷酸重复分别为12.99%和2.04%。单核苷酸重复主要为A/T(44.38%),二核苷酸重复主要为AC/GT(12.99%)和AG/CT(8.05%)。基于筛选的SSR位点设计引物,随机挑选24对引物,对10个不同地理种群意大利蝗成虫DNA样品进行PCR扩增,共有6对引物扩增成功。【结论】本研究利用转录组数据发掘意大利蝗SSR位点,为意大利蝗分子标记、种群遗传及功能基因等研究奠定基础。     

珍贵树种火力楠转录组SSR特征分析

为了全面了解珍贵乡土树种火力楠转录组SSR位点的分布及序列特征,为火力楠遗传资源的保存和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。利用Illumina Hiseq2000高通量测序平台对火力楠进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。分析的结果显示发现含SSR的序列21 218条,共得到27 379个SSR,出现频率为28.08%,平均约每3 kb出现1个SSR。单碱基和二碱基重复为火力楠SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的42.18%和35.66%,所有重复基元共85种,其中(A/T) n所占比例最高41.65%,然后是(AG/CT)n(29.47%)、(AAG/CTT)n (6.83%)和(AC/GT)n (4.11%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现24 668个SSR位点,其中3 805个位于编码区,出现频率为0.099 SSR/kb,而非编码区为0.287 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(2 030, 53.35%)。在SSR序列长度方面,长度变化范围最大的为单碱基重复SSR,其次是二碱基重复。火力楠转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

墨西哥湾扇贝与“中科红”海湾扇贝群体遗传多样性SSR分析

利用微卫星(SSR)分子标记技术,对墨西哥湾扇贝和"中科红"海湾扇贝2个群体共80个个体的遗传结构和遗传多样性进行分析。结果显示:6个微卫星位点共扩增出31个等位基因,各位点的等位基因数为4~8个,平均等位基因数为5.2个;墨西哥湾扇贝与"中科红"海湾扇贝群体平均有效等位基因数(Ne)分别为2.890、2.753;平均观测杂合度(Ho)分别为0.415、0.353;平均期望杂合度(He)分别为0.604、0.479;多态信息含量(PIC)分别为0.554、0.444;两群体具有相同的等位基因数(Na)(4.333)。Hardy-Weinberg平衡检验发现,2个群体各有3个位点(50%)偏离平衡(p0.05),且均表现为杂合子缺失。两群体的遗传分化指数(Fst)为0.109 7,遗传距离(Dxy)为0.316 4,遗传相似性系数为0.728 8。研究结果说明:两个群体均保持较高的遗传多样性,但经过多年的定向选育,"中科红"海湾扇贝群体的遗传多样性低于墨西哥湾扇贝群体且两个群体具有中等程度的遗传分化,存在一定的遗传差异。     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

三种人参属植物的EST-SSR信息分析及其在三七中的应用

为了解人参属植物EST中SSR分布特点及其在三七SSR标记中的应用,利用生物信息学方法,用primer 3软件对dbEST数据库中人参属植物人参、西洋参和三七的EST序列进行搜索,发现人参属植物EST-SSR出现频率为11.54%,平均每4.39 kb出现1个SSR.人参属植物单核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元和二核苷酸重复基元,分别占总SSR的54.48%、17.31%和16.36%.人参属EST-SSR的优势类型为A/T和AT/TA,分别占54.73%和8.21%.根据人参属植物EST中的SSR设计48对引物,在合适的PCR扩增体系下,用5个三七样品的DNA为模板进行PCR扩增,引物有效扩增率85.42%,其中多态性引物占可扩增引物的70.73%.结果表明,利用人参属EST序列开发三七EST-SSR标记是可行的.     

闽楠转录组分析及基因功能注释

采用第二代Illumina HiSeq测序技术对闽楠的木质部、韧皮部、叶片进行转录组测序，分别获得Clean Reads片段41 383 707条、43 343 922条、44 191 586条，经转录本拼接后得到序列总长度达120 535 288 bp的383 331条Conting片段，进一步组装得到平均长度为542 bp的151 729条Unigenes。将闽楠转录组Unigenes进行基因功能注释，与NR数据库比对发现，其与葡萄的相似序列最多（34%），与黄瓜、野草莓、大豆的同源性较低（各占3%）；进行GO功能注释，可将其划分为生物过程、细胞成分、分子功能3大类共计52个分支，与eggNOG数据库比对可分为25类，通过KEGG功能注释可知转录组中涉及的基因共参与了176条代谢通路，其中核糖体和碳代谢获得的注释较多。另外通过MISA软件分析，共获得35 972个SSR位点。其中，单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型，SSR位点数分别为21 762（60.50%），8 931（24.83%），4 924（13.69%）。闽楠转录组分析及基因功能注释为深入开展闽楠遗传育种及分子生物学相关研究奠定基础。     

文冠果果实转录组测序及分析

为了研究文冠果果实转录组中功能基因表达情况,采样RNA-seq技术对文冠果不同发育时期果实进行测序分析。结果显示:两个时期样品材料测序组装后共获得68 298个Unigene序列,有24 691个Unigene得到注释,占36.15%;GO数据库注释显示14 766条Unigene分为细胞组分、分子功能及生物学过程3大类54个功能组;KOG数据库中注释到的13 994条Unigene功能系统分为25类;以KEGG代谢途径数据库为依据,可将8 284个文冠果果实转录组Unigene分为127个代谢通路;在文冠果果实转录组中发现11 732个SSR位点,其中最多的为单核苷酸SSR,占60.85%。本研究为文冠果果实分子生物学研究提供了一定的基础和参考。     

基于高通量测序的辽东栎转录组学研究

应用Illumina Solexa Hiseq 2000高通量测序技术对辽东栎的芽、花、叶及果实的混合样品进行转录组测序,结果共获得3.8 Gb的有效数据。应用Trinity软件对有效序列从头拼接去重复后,共获得95 800条unigene,总长度为73.57 Mb,最大长度、平均长度和N50分别为11 284 bp、768 bp和1 373 bp。利用Blastx与公共数据库Nr和Swiss-Prot的同源性比较(E值1×10-5)发现,38 163条unigene未发现与公共数据库中的序列具有同源性。通过KEGG数据库中参与淀粉合成与代谢的pathway分析,共发掘出67条参与淀粉合成的unigene,编码9个关键酶。此外,在13 380条unigene中共搜索到15 901个SSR位点,其中二核苷酸和三核苷酸的重复类型占所有SSR位点的98.16%。