金黄色葡萄球菌生物膜形成机制研究进展

金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染最常见的病原菌之一,而且可形成生物膜,从而导致生物膜相关疾病的产生。患者一旦发生金黄色葡萄球菌生物膜感染,难以彻底治愈。深入研究金黄色葡萄球菌生物膜形成的分子机制和调控网络,对寻找有效的防治、治疗药物和手段具有重要意义。我们就金黄色葡萄球菌生物膜形成过程和调控机制的研究近况做一综述。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光技术特异定量检测金黄色葡萄球菌

基于重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法建立特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法。优化设计合成溶葡球菌酶序列,构建重组表达载体pQE30-Lys,转化至大肠杆菌M15并诱导表达,镍柱纯化得到目的蛋白。利用重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法特异定量检测金黄色葡萄球菌并与平板计数对比。成功表达了重组溶葡球菌酶,并建立了特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法,与平板计数具有显著线性关系。本研究建立的将重组溶葡球菌酶和ATP生物发光法相结合的检测方法操作快捷简单,具有良好的应用前景。     

金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络及功能

【目的】金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,是目前最难以对付的病菌之一。它能引起多种感染,特别是在医院环境中。近年来,抗药性金黄色葡萄球菌传染更加严重,已成为公共卫生威胁。由于以前对于金黄色葡萄球菌的实验性研究大都是基于单个基因或者蛋白进行的,为了更好的研究这个物种,有必要从整体上把握金黄色葡萄球菌的蛋白作用机理。【方法】采用系统发生谱、操纵子法、基因融合法、基因邻近法、同源映射法等五种计算方法预测金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络。【结果】从蛋白组的角度构建了金黄色葡萄球菌蛋白相互作用网络,并对网络进行功能分析。【结论】网络的分析表明金黄色葡萄球菌的蛋白质相互作用网络也服从scale-free属性,发现了SA0939、SA0868、rplD等重要的蛋白。通过对金黄色葡萄球菌的重要的细胞壁合成和信号转导调控蛋白局部网络分析,发现了一些对这两个系统十分重要的蛋白分子,这些信息将为更好的了解金黄色葡萄球菌的致病机理和开发新的药物靶点提供指导。     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220△nuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失.研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2莫玭uc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株.经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1.     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220Δnuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease,SNase）,命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶（Thermonuclease,TNase）,命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。本研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了七轮培养和筛选,同源重组几率为2%（7/345）,筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。     

中药单体抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的研究进展

金黄色葡萄球菌是一种临床上十分常见的病原细菌,其在医疗器械和植入物上形成的生物被膜赋予了金黄色葡萄球菌极强的抗生素耐药性,导致相关慢性感染难以彻底根除,从而对人类健康产生极大的威胁。天然产物来源的活性单体成分在抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成方面发挥了重要的作用,为抗细菌生物被膜研究提供了新策略。围绕金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中的分子调控机制,以及中药单体的抑制机制展开介绍,旨在为抑制细菌生物被膜感染的中医药基础研究提供理论参考。     

利用荧光标记高通量鉴定减数分裂重组抑制突变体

正向遗传学突变体筛选被广泛用于揭示减数分裂中涉及的遗传基因, 如调控减数分裂II型交叉形成途径的重组抑制基因。该研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉荧光标记系进行EMS突变体的正向遗传学筛选, 鉴定拟南芥野生型Col遗传背景下的重组抑制突变体, 共获得18个重组率显著提高3倍以上的重组抑制突变体, 其中包括显性和隐性遗传突变。研究表明, 基于荧光标记高通量鉴定重组抑制突变体是可行的, 可为植物减数分裂重组调控分子机制研究提供新方法和突变材料。     

利用荧光标记高通量鉴定减数分裂重组抑制突变体

正向遗传学突变体筛选被广泛用于揭示减数分裂中涉及的遗传基因, 如调控减数分裂II型交叉形成途径的重组抑制基因。该研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉荧光标记系进行EMS突变体的正向遗传学筛选, 鉴定拟南芥野生型Col遗传背景下的重组抑制突变体, 共获得18个重组率显著提高3倍以上的重组抑制突变体, 其中包括显性和隐性遗传突变。研究表明, 基于荧光标记高通量鉴定重组抑制突变体是可行的, 可为植物减数分裂重组调控分子机制研究提供新方法和突变材料。     

基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、高效、准确地实现基因组编辑,因而在功能基因研究中得到更广泛应用。而基于CRISPR/Cas9系统的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选技术平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,为分子病毒学和免疫学提供了强大的研究工具。本文主要总结了基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台的具体筛选流程,归纳和讨论了该平台在筛选调控病毒复制相关宿主因子中的应用现状和发展前景。     

金黄色葡萄球菌壁磷壁酸致病与免疫的分子机制研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)壁磷壁酸(wall teichoic acids, WTAs)是多元醇经由磷酸二酯键共价连接组成的细胞壁表面阴离子糖类聚合物,参与调节细胞壁的稳态并介导细菌毒力。金黄色葡萄球菌WTAs与宿主细胞表面特定的受体结合,可诱导天然免疫和获得性免疫应答。此外,金黄色葡萄球菌WTAs还参与调控毒力基因的表达,有助于细菌的定殖感染,在基因工程靶标治疗和噬菌体药物治疗方面具有广泛的应用前景。本文对金黄色葡萄球菌WTAs的合成进行了概述,综述了WTAs对宿主免疫应答的调控作用,以及在细菌对宿主侵袭与定殖中的致病机制,并归纳WTAs的耐药分子机制和作为药物治疗靶标的研究现状。这些研究为揭示WTAs的致病与免疫分子机制提供研究思路,为预防和治疗金黄色葡萄球菌的感染提供新的策略。     

产SEB金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因缺失菌株的构建

构建产肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B ,SEB)的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素（α-hemolysin, α-HL)缺失菌株。首先构建用于α-HL基因敲除的同源重组质粒pMHL-α,经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代,最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证明最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为野生型金黄色葡萄球菌的体内遗传操作及构建产超抗原药物金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。     

金黄色葡萄球菌基因组表达文库的构建及免疫学初步筛选

为从基因组水平筛选金黄色葡萄球菌疫苗抗原,建立金黄色葡萄球菌基因组表达文库,用患者恢复期血清对表达文库进行血清学筛选,并对获得的阳性克隆进行序列测定及同源性分析。结果显示,构建的金黄色葡萄球菌基因组表达文库共有5×10~4个克隆,片段插入正确率为91.67%。对文库进行初步筛选,共获得6个阳性克隆,经测序鉴定和同源性分析发现6个克隆涉及金黄色葡萄球菌基因组6个开放阅读框(ORF)。结果表明,本研究建立的疫苗抗原筛选方法可用于金黄色葡萄球菌疫苗抗原的系统筛选。     

乳酸菌的基因组编辑技术研究进展

乳球菌(Lactococcussp.)和乳杆菌(Lactobacillussp.)是工业上常用的乳酸菌(lacticacid bacteria,LAB),长期应用于食品和饮料的发酵。近年来,随着分子操作及遗传改造技术的不断完善,推动了乳球菌和乳杆菌的基础和应用研究,其作为功能菌株和工业微生物细胞工厂的重要潜能也不断突显出来。本文综述了工业常用乳酸菌的基因组编辑技术研究进展,着重介绍了基于整合质粒的敲除、敲入,基于基因组重组工程的精细修饰和敲除、敲入,以及基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9[(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9 (Cas9), CRISPR/Cas9]系统的基因组编辑技术。     

CRISPR基因组编辑技术在传染病致病机理研究和防诊治中的应用

CRISPR基因组编辑技术在基因操作和传染病研究等方面展现出巨大的应用前景,对于有效控制和治愈传染病具有重要价值。通过其构建的细胞、类器官和动物疾病模型,为探索传染病相关分子机制提供了极大便利。CRISPR筛选技术使得高通量鉴定传染病相关风险因子成为可能。基于CRISPR的新型分子诊断工具为病原体的检测提供了更灵敏和快速的方法。利用CRISPR工具敲入抗性基因或破坏风险基因和病毒基因组,有望实现预防或治疗传染病。本综述讨论了CRISPR基因组编辑技术在疾病模型制备、传染病风险因子筛选、病原体诊断和传染病防治中的应用,以期为后续传染病的研究和防诊治提供参考。     

金黄色葡萄球菌持留菌形成机制的研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的院内感染致病菌,是导致人类各类感染最重要的病原体之一。金黄色葡萄球菌耐药问题一直是临床慢性感染治疗的最大障碍。随着细菌耐药机制研究的不断深入,研究者发现持留菌可能是导致疾病的持续性和复发性感染的真正原因。近年来持留菌的存在引起的耐药问题被高度重视,金黄色葡萄球菌持留菌的基本特征和形成机制的研究对临床上更好地控制耐药及感染问题具有重要的意义。为此,本文将从金黄色葡萄球菌持留菌的特性、生物膜、能量代谢、基因调控等多方面对金黄色葡萄球菌持留菌进行系统全面的综述。     

金黄色葡萄球菌凝集因子B的原核表达及其抗血清调理吞噬活性

金黄色葡萄球菌是导致医院院内感染的主要病原。由于金黄色葡萄球菌极易产生抗药性,因此疫苗免疫是预防该细菌感染的主要手段。作为一个粘附分子,凝集因子B(ClfB)的作用是使金黄色葡萄球菌能够在宿主黏膜定植,是预防该菌感染的一个重要的靶分子。本研究成功地在大肠杆菌中表达了可溶的ClfB N1-N3结构域蛋白(Truncated-ClfB),并且利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤技术对其进行了纯化。用纯化后的Truncated-ClfB免疫新西兰大白兔,收集三免后的血清检测其抗体水平并且利用流式细胞术检测抗血清的调理吞噬活性。检测结果表明,三免后的兔源Truncated-ClfB抗血清抗体效价高达1:640 000;与免疫前兔源血清相比,兔源Truncated-ClfB抗血清能够显著增加多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes,PMN)对金黄色葡萄球菌的吞噬效率(P0.01)。结果表明Truncated-Clf B有希望作为金黄色葡萄球菌疫苗的候选抗原。     

金黄色葡萄球菌分子检测技术的常用靶基因

金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌,可以产生多种毒素并具有广泛的耐药性。从特异性基因位点、抗药性基因和毒素基因3个方面列举了检测金黄色葡萄球菌的靶基因以及利用这些靶基因的PCR检测方法。详细说明了这些基因的发现、功能和实际应用情况。将金黄色葡萄球菌分子检测的思路和方法进行汇总、比较,并对未来的相关研究趋势和研究领域进行了展望。     

耐万古霉素的金黄色葡萄球菌

目前认为万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌菌株一般从苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌转变而来。万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌感染患者往往长期使用万古霉素或有慢性疾病。目前还没有系统检测万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌的试验。如果用万古霉素治疗苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌感染失败,临床医生应警觉是否为万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌感染。     

噬菌体展示技术系统发展进展

噬菌体展示技术(Phage display technology,PDT)是一种特殊的基因工程重组表达技术,噬菌体展示技术系统(Phage display system,PDS)是指包括经过遗传改造后的系列噬菌体、辅助噬菌体、宿主细菌等集成平台(含试剂盒)。文章从噬菌体分子遗传学及其基因(基因组)遗传工程改良角度,基于噬菌体M13、λ、T4和T7等4大类典型噬菌体展示技术系统的发展进展进行了综述。重点强调不同展示系统中的核心部件及其基因工程改造的分子遗传学原理、不同展示锚定位点的技术特征、相关试剂盒的研制状况及选择依据。