SYBR Green实时荧光PCR高通量检测转基因大豆油

采用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立了食用大豆油转基因成分的检测方法.根据转基因大豆中内源参照基因lectin和外源基因35S启动子、NoS终止子和ep4 epsps基因,设计特异性引物,在Roche荧光PCR仪上进行实时荧光PCR扩增.荧光曲线表明,SYBR Green实时荧光PCR可特异性地检测大豆油中的转基因成分,方法准确、快速,并运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性,检测方法灵敏度高.     

猪源性成分检测中3种DNA提取方法比较

为了达到对动物源性成分快速、准确的检定,对提取动物源性基因组DNA的方法进行了比较分析。考察酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和试剂盒法这3种方法对DNA提取的浓度、纯度及实时荧光PCR扩增效果的影响。结果表明:酚-三氯甲烷法提取DNA浓度最高,试剂盒法纯度最高且实时荧光PCR扩增效果最好,但PVP法操作简单、安全、经济,提取的DNA用于实时荧光PCR扩增检出限可达1.98 pg/μL。使用PVP法对市场上10份不同类型的动物性产品进行了检测,检出两份产品中含有猪源性成分。PVP法应是3种方法中的首选方法,本文为实验室选择合适的DNA提取方法提供了依据。     

实时荧光PCR法同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分

大豆、芹菜等食品原料是一些特殊人群的致敏原。根据大豆atp A基因和芹菜mtd基因设计特异性引物,利用不同荧光素标记的Taq Man探针,建立了一种实时荧光PCR检测方法,可同时检测食物中大豆和芹菜致敏原成分。分别以大豆、芹菜、大米、小麦、大麦、花生、芝麻、玉米、马铃薯、蕃茄、核桃、开心果、腰果、葵花籽、杏仁、苹果、梨、草莓、猪肉、牛肉、羊肉及鱼肉等材料的基因组DNA作为模板,进行PCR扩增实验,结果发现该方法仅能特异性扩增大豆和芹菜致敏原成分。灵敏度测试结果表明大豆和芹菜成分的检出限均达0.01%。因此,本方法可以作为同时检测食品中大豆和芹菜致敏原成分的特异性方法。     

双重实时荧光PCR定量检测动物产品中牛源性成分

旨在建立一种定量检测动物产品中牛源性成分含量的双重实时荧光PCR方法。以牛卫星IV DNA为检测靶基因,以肌肉生长抑制素基因作为内对照合成引物探针,采用基于TaqMan的双重实时荧光PCR技术对已知牛肉添加比例的冻干混合肉粉标准品进行检测并建立线性模型,并应用模拟样品和送检样品进行了验证检测。结果显示,该方法可检出牛源成分含量为0.1%的冻干肉粉,不与其他种动物组织发生交叉反应,重复性试验的相对标准偏差小于5%,方法的扩增效率为93.6%。该方法适用于肉品中牛源性成分的定量检测,可用于测定市场上动物产品中的牛源性成分含量。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.     

实时荧光PCR检测食品中致敏原芥末成分

对植物原料产品和植物源性食品中芥末成分的快速鉴定是避免过敏性疾病发生的重要措施。依据芥末Sin A1管家基因的核酸序列设计特异性引物和探针,对3种芥末样品和21种非芥末植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,过敏原芥末管家基因的样品FAM通道有荧光信号检出,非芥末样品FAM通道均无荧光信号检出。灵敏度实验表明,植物原料产品中对芥末的检测低限可达到1 mg/kg。此外对市售的芥菜籽等样品和深加工的芥末致敏原参考物质(葡萄糖)进行实际样品的检测,均能很好检出致敏原芥末成分。     

基于微滴式数字PCR检测肠癌病人游离环状DNA KRAS突变的新方法

基于微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)设计一种检测肠癌游离循环DNA(Circulating cell free DNA,cf DNA)中KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog)基因突变的新方法并评估其灵敏度和准确性。根据肠癌病人KRAS基因的突变类型设计并合成,采用dd PCR扩增并评估其灵敏度和准确性;根据AMRS-PCR引物设计原理设计KRAS基因的实时定量PCR扩增引物并评估其准确性,进而比较dd PCR和q PCR二者之间的优缺点;最后针对52例肠癌病人的cf DNA采用dd PCR进行检测,研究dd PCR在cf DNA KRAS基因突变检测的应用。成功使用dd PCR和q PCR两种方法对KRAS野生型及7种突变型建立检测方法,使用质粒标准品及实际样品验证该两种方法可行并对其假阳性率、线性范围及检测下限等性能进行了评价,最后成功对52例临床患者和20例正常人的血浆cf DNA样本进行检测,临床灵敏度为97.64%,临床特异性为81.43%。dd PCR的检测性能优于q PCR,LOD达到个位数DNA拷贝,最低可确认突变浓度达到0.01%–0.04%。样本提取效率在方法学建立中也十分重要,直接影响到灵敏度和Cut Off值的判定。临床患者检测结果显示其KRAS突变率接近报道水平。     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

寡核苷酸芯片法、实时PCR 和测序法进行乙肝病毒 基因分型的比较

目的:比较寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法在对慢性乙肝患者病毒基因分型的比较和方法学评价。方法:对126例不同基因型的慢性乙肝患者的血清样本分别用寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR法和测序法进行基因分型,并评价各种方法的临床表现、所需时间和检测成本。结果:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR分别能检测到1%和0.1%比例的基因型。在126例慢性乙肝患者的临床样本中,寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR和测序法分别检测出41(33%)、41(33%)和45(36%)例为B型,76(60%)、76(60%)、81(64%)例为C型。寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR均检出9例B、C混合基因型。在三种检测方法中实时荧光PCR是最快速和廉价的。结论:寡核苷酸芯片法、实时荧光PCR能检出B、C混合基因型,而测序法只能检测出样本的主导基因型。     

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用北大核心CSCD

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。     

加工产品中转基因玉米Bt11成分实时荧光PCR定量(性)检测

实验在玉米自身基因和外源基因的边界序列之间设计了具有品种和品系特异性的引物和探针 ,并以实时荧光PCR技术 ,建立了加工产品中转基因玉米Bt1 1成分品系鉴定检测和定量检测的方法。实验对加热条件和时间对检测转基因成分的影响作了探讨 ,并检测了部分市售食品和饲料。检测结果发现 ,加热时间温度越高、时间越长 ,对转基因成分定量检测的影响越大 ;在所检测的样品中可以检测出转基因玉米Bt1 1成分 ,有些样品还同时检出其他转基因成分。本研究实验建立的方法 ,可以用于加工产品中转基因成分的定量检测 ,也可以用于定性检测 ,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

运用数字PCR检测乳腺癌组织FFPE样品中人表皮生长因子受体2拷贝数的变化

目的:建立数字PCR(dd PCR)法检测乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片样品中人表皮生长因子受体2(HER2)的拷贝数变化(CNV),并与免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)结果比较,以寻求更客观、准确、通量的肿瘤标志物检测方法。方法:以细胞系293T、HOEC、SKOV3基因组DNA(g DNA)为模板,对靶基因HER2及校正基因CEP-17建立双通道dd PCR检测法,并对21例IHC检测HER2阳性(++/+++)的乳腺癌FFPE样品进行CNV(HER2/CEP-17)检测,与IHC、FISH结果比较。结果:单、双通道法对HER2 CNV检测结果一致;细胞及临床样品检测结果表明,dd PCR检测HER2 CNV的阴性、阳性Cut-off值分别为1.2、2.1,中间值为1.2~2.1。14例FISH阴性标本中,dd PCR的一致性为93%(13/14);3例IHC"+++"的样品中,FISH检测均为阳性,2例dd PCR检测为阳性,1例(17#)检测临界阳性。2例IHC"++"的样品,FISH检测阳性,但dd PCR检测为阴性。结论:dd PCR能检测样本HER2 CNV,且与FISH结果判读部分一致,具有临床应用前景,但仍需大量样品来进行验证及建立结果判断标准。     

不同方法检测鸡胴体中沙门菌结果的比较研究

对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。     

miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的 为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR (real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法 设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果 优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论 该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。     

实时荧光PCR法检测肉制品中鸡、鸭源性成分

根据鸡、鸭线粒体DNA(mt DNA)序列设计了鸡、鸭特异性引物及Taqman探针,建立了肉制品中鸡、鸭源性成分的实时荧光聚合酶链式(real-time PCR)检测方法。结果发现:利用此方法,两种动物源性的最低检出限值(质量分数)分别为0.01%和0.001%。实时荧光PCR法能够作为肉制品中检测鸡、鸭源性成分的有效方法。     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

饲料中狐狸、水貂、貉子和狗源性的五重实时荧光PCR检测方法的建立

为了快速鉴别饲料中的狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,根据线粒体16S r DNA种间保守序列,设计合成针对狐狸、水貂、貉子和狗的特异性引物和探针,通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了多重实时荧光PCR方法,在同一PCR反应体系中可以同时完成4种动物源性成分检测。通过对15种其他物种的源性成分的检测,结果表明所设计的引物和探针具有很好的物种特异性,且灵敏度高,狐狸、水貂、貉子和狗的DNA检出限为0.01ng。对40份样品检测,其中5份检测出貉子、狐狸和水貂源性成分。结果表明,该方法可以有效地鉴别出饲料中狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,同时适用于相关动物产品中。     

Taqman多重实时荧光PCR同步定量检测6种动物源性成分方法的建立

旨在建立一种可同时检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种动物源性成分的六重实时荧光定量PCR方法。根据猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅细胞核基因组保守序列,参照序列比对结果选择差异位点设计6对特异性引物和6条以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立能同步定量检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光PCR方法。应用此方法分别对18种不同源性动物DNA和200份不同来源样品进行猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分检测,结果表明,所建立的六重实时荧光PCR方法灵敏度高,对六种动物的最低核酸检测量分别为0.049ng、0.048ng、0.085ng、0.13ng、0.162ng、0.074ng(50μl体系);特异性强,对狗、兔、鼠、驴、马、骆驼等其他12种动物无特异性扩增;200份样品的检测结果表明六重qPCR检测方法敏感,同一反应体系下实现一次对6种动物快速定量检测,耗时短、效率高、适用性广,可用于肉品、奶品、皮毛和饲料等动物产品猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分单一或混合物种的鉴别诊断。