大肠杆菌（Escherichia coli）LexA蛋白的结构与功能

LexA蛋白首先在大肠杆菌（Escherichia coli）中作为SOS反应的重要调节因子之一被发现. LexA蛋白含有202个氨基酸,由N端DNA结合结构域和C端催化核心结构域构成. 细胞中LexA蛋白大都以二聚体形式存在,并且有可切割和不可切割两种构象. 在正常生理条件下,LexA特异性结合16 bp的保守序列5′-CTGTN8ACAG-3′,即SOS盒,抑制约50个基因的表达. 当发生DNA损伤时,活化的RecA蛋白通过稳定LexA蛋白可切割构象,促进LexA蛋白Ala84-Gly85间肽键的切割,产生的C端LexA85 202和N端LexA1 84被蛋白酶ClpXP和Lon快速降解. LexA蛋白切割后,SOS基因以一定的顺序开始表达,并且完成DNA损伤修复. 本文回顾和总结了LexA蛋白分子结构,自我切割分子机制和影响因素,以及在SOS反应中的作用等方面的研究进展. 同时,也讨论了LexA蛋白在原核细胞中的进化保守性.     

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)recA基因的克隆与原核表达

SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因rec A(recombinase A),并对rec A基因进行了生物信息学分析。并构建了rec A基因的原核表达载体PGEX-rec A,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达,对Rec A蛋白的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,rec A基因的开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,Rec A蛋白理论分子量为25.29 k D。重组蛋白表达的优化条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

长春花金属硫蛋白基因原核表达载体的构建及表达研究

将从长春花中克隆的金属硫蛋白基因（GenBank登录号：DQ016341）构建到高效原核表达载体pGEX-6P-1,并命名为pGEX-6P-1-CrMT,并对GST-CrMT融合蛋白的表达进行诱导和条件优化。对不同的诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,随诱导时间增长GST-CrMT融合蛋白表达量提高,22℃,24 h和37℃,240 min均能诱导GST-CrMT融合蛋白的最大量表达,在0.8 mmol·L^-1 IPTG浓度下可以有效诱导GST-CrMT融合蛋白的表达。     

毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。     

Barnase在大肠杆菌中的分泌表达和诱导条件优化

从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase基因及其抑制剂barstar基因,采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略,以pET-22b（＋）质粒为基础,构建大肠杆菌分泌型表达质粒．IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析并从诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间三方面初步优化诱导表达条件．     

小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

小麦Fe超氧歧化酶基因的原核表达分析

采用RT-PCR技术分离小麦Fe超氧歧化酶基因(FeSOD)的ORF全长cDNA,然后构建其原核表达载体,并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行优化,以期获得较大量的重组蛋白。结果表明:实验获得了小麦FeSOD基因的ORF全长（600 bp）,ORF全长与原核表达载体pET-Dute1相连接构建了原核表达载体pET-FeSOD,将pET-FeSOD导入宿主菌Rosetta(DE3)中,经SDS-PAGE电泳结果显示,可以高效表达融合蛋白且表达的蛋白均主要以包涵体的形式存在;重组质粒表达出25.8 kD的融合蛋白,除去载体pET-Duet1自身表达的3.0 kD蛋白后,与FeSOD编码的约为22.8 kD蛋白的大小一致;对诱导表达条件的优化结果显示,融合蛋白 pET-FeSOD最佳的诱导表达条件为:0.5 mmol/L的IPTG浓度,37 ℃诱导5 h。该研究结果为进一步深入研究该基因的特性与功能奠定了基础。     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能, 对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列, 利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列, 利用SLIC (Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中, 成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达, 通过改变培养温度和IPTG浓度等条件, 得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明: 大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌; 18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达; 0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达, 增加IPTG浓度(0.1 mmol/L~1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达, 其分子量大小与预期相符。     

乙肝e抗原在大肠杆菌中的高效表达和优化

目的:探讨乙型肝炎病毒e抗原基因在大肠杆菌中进行高效融合表达,并对表达条件进行优化和影响因素的分析.方法:从乙肝患者阳性血清中提取DNA,设计引物扩增目的基因,按常规方法克隆入pET-GST载体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳.对表达条件进行正交试验优化,并分析其影响因素的大小.结果:HBeAg以包涵体形式表达出来,其表达的GST融合蛋白的分子质量大约为44KD.最佳的表达条件为温度为30℃,IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为2h.其影响因素大小依次为诱导温度＞诱导时闻＞IPTG浓度.结论:乙肝e抗原基因在大肠杆茵中获得了高效表达.     

铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白LexA的复性及活性研究

目的:对LexA蛋白复性方法进行优化,对复性后的LexA蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性LexA蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的LexA蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱盐,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC法检测复性效果,Western blot法分析复性前后及经DTT处理后的LexA蛋白的免疫反应性,凝胶滞留电泳试验检测复性LexA蛋白与DNA的特异性结合能力。结果:复性后的LexA蛋白出现单体和多聚体的形式,多聚体是由单条肽链聚合而成。LexA单体和多聚体与兔抗LexA多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的LexA蛋白能与SOS盒序列发生特异性结合。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的:通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体。方法:将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度、诱导剂IPTG终浓度、诱导时间等条件进行优化;利用12%SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA、Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性。结果:构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0. 2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1. 35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核。结论:利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体。     

木薯MeNINV4基因在原核细胞中的表达及优化

转化酶是植物中蔗糖降解过程的关键酶之一,可催化蔗糖不可逆地分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育、平衡碳水化合物及对逆境胁迫的响应等方面具有重要的作用。本研究利用从木薯中克隆到碱性/中性转化酶MeNINV4基因,将其重组构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeNINV4-pGEX-6p-1,并对其融合蛋白表达的IPTG诱导浓度、起始菌液浓度、诱导温度和诱导时间条件进行优化。研究结果发现:GST-MeNINV4融合蛋白的表达量在一定范围内随着IPTG诱导浓度、起始菌液浓度和IPTG添加时间的增加而增加。重组菌在OD_(600)为1.0左右,IPTG浓度为0.6 mmol/L,在37℃条件下诱导5 h后,重组蛋白的表达量达到最大值。本研究通过诱导目的蛋白在原核细胞中的表达并且优化表达条件,使目的蛋白在原核细胞中的表达量显著增加,为进一步研究目的蛋白的结构、功能及酶学特性等生物学功能提供理论依据。     

猪SsBHMT基因的原核表达及条件优化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）是一种甲基代谢酶,催化甜菜碱转甲基到高半胱氨酸生成甲硫氨酸。对含有pET30a-SsBHMT重组质粒的菌株进行诱导表达分析,通过对菌株、IPTG诱导浓度、时间等诱导表达条件进行优化,结果表明：该目的蛋白主要以包涵体的形式出现;经过条件优化,目的蛋白表达量在上清和沉淀中均有所增加,但仍主要以包涵体的形式存在;大肠杆菌菌株ER2566为适合目的蛋白表达的菌株;在37℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为10 h的条件下,目的蛋白表达量最多。研究结果为进一步蛋白纯化与抗体制备奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的 优化及反应活性

目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白(64.4kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0mmol/L、诱导时间16h。结论原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。     

乳糖诱导甜蛋白Monellin在大肠杆菌中的表达

根据已报道的单链Monellin甜蛋白的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,设计和人工合成了单链monellin基因。将单链monellin基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建了重组表达载体pET28a-mon,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Monellin的大肠杆菌工程菌株。借助SDS-PAGE分析方法,研究了乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌表达甜蛋白Monellin。通过对乳糖作为诱导剂表达条件进行优化,Monellin的表达量可占细胞总蛋白的33.09%,与IPTG诱导表达量接近。本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产甜蛋白Monellin提供了参考依据。     

可溶性泛素样特异性蛋白酶1的表达及活性鉴定

目的:高效可溶性表达泛素样特异性蛋白酶1(ULP1)。方法:根据大肠杆菌密码子的偏好性优化合成编码ULP1的基因片段序列,将其克隆到原核表达载体p GEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达8 h,观察重组蛋白ULP1的表达情况;优化诱导时间及IPTG浓度,并鉴定重组蛋白ULP1的生物学活性。结果:重组蛋白ULP1表达的最佳条件为37℃、0.1 mmol/L的IPTG诱导表达5 h,目的蛋白以可溶性表达为主;Western印迹结果表明,重组蛋白ULP1能够被His单克隆抗体识别,重组蛋白ULP1能够特异性酶切SUMO-GFP。结论:表达了具有生物学活性的SUMO蛋白酶ULP1。