枸杞WRKY_3基因克隆及组织表达分析

以枸杞为材料,采用PCR及RACE方法,克隆了枸杞WRKY转录因子基因cDNA序列,命名为Lb WRKY3,GenBank登录号为KX196192。在生物信息学分析的基础上,进行亚细胞定位、基因表达分析。结果显示:(1)Lb WRKY3开放阅读框ORF长度为1 068bp,编码356个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,Lb WRKY3编码蛋白具有一个WRKY结构域,二级结构中不规则卷曲结构所占比例最大(58.67%),延伸链结构次之(18.88%),α螺旋比例为15.82%,β转角最少,仅为6.63%;Lb WRKY3蛋白与案头菊WRKY蛋白、黄花蒿WRKY蛋白相似性较高。(3)亚细胞定位显示,Lb WRKY3蛋白定位于细胞核。(4)实时定量PCR分析表明,Lb WRKY3在根中表达量最高,在花中表达量最低;在枸杞果实发育过程中Lb WRKY3均有表达,表达量随果实成熟逐渐升高,并于35d达到峰值;Lb WRKY3基因在果实中的表达具有组织特异性表达特性(果肉果皮种子)。研究表明,Lb WRKY3基因参与了枸杞果实生长发育调控。     

枸杞Lb14-3-3b基因的表达分析及转烟草研究

在宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)品种宁杞1号花药发育差异蛋白质组学研究的基础上,克隆了一个花药发育相关基因Lb14-3-3b,证实该基因在花器官中优势表达。本试验进一步利用荧光定量PCR技术分析枸杞Lb14-3-3b基因在花药发育过程中不同时期的表达特征,并通过构建植物过表达载体Lb14-3-3b-pCambia1305. 1-35s,经根瘤农杆菌介导法转化模式植物烟草,探究该基因在植物生长发育中的功能。结果表明,在枸杞花药发育的各个时期,Lb14-3-3b都有表达,在花药二核花粉时期表达量最高。与野生型烟草相比,转Lb14-3-3b基因烟草生长发育迟缓,植株矮小,花器官畸变,花瓣缺少致使花型趋于四角化,雄蕊及花丝数目缺少且发育异常。推测枸杞Lb14-3-3b基因在烟草生长发育及花器官发育中起调控作用,研究结果为进一步探讨该基因在枸杞生长发育中的调控作用提供参考依据。     

黑果枸杞和宁夏枸杞FT(Flowering Locus T)基因的克隆及表达分析

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)和宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)系茄科枸杞属植物,具有非常重要的药用价值。本研究通过挖掘黑果枸杞和宁夏枸杞的转录组数据克隆获得其开花关键基因FT(Flowering Locus T),分别命名为Lr FT和Lb FT,通过生物信息学方法分析两个蛋白质的氨基酸序列、功能域及其系统发育关系等;并通过实时定量PCR分析其在两种枸杞不同组织中的表达模式。研究结果表明:Lr FT和Lb FT均编码一个由173个氨基酸组成的蛋白质。蛋白序列分析表明:Lr FT和Lb FT序列相似度达98%,具有保守的PEBP(phosphatidylethanolamine-binding protein)结构域。系统进化分析表明:Lr FT和Lb FT与茄科植物番茄、烟草和马铃薯的FT亲缘关系较近。基因表达结果表明:Lr FT和Lb FT主要在叶片中表达,且在两种枸杞的叶片中表达量有一定的差异。本研究为今后黑果枸杞和宁夏枸杞开花相关功能基因的验证及分子育种奠定了一定的基础。     

小麦转录因子TaWRKY74-c和TaWRKY74-d基因的克隆及基于生物信息学的功能分析

WRKY基因是近年来研究较为广泛的植物转录因子,目前许多物种中都克隆出WRKY基因。近年来,小麦中也有WRKY基因被克隆,但是由于对WRKY基因生物信息学分析不足,导致研究带有一定的盲目性。本试验以小麦品种扬麦158叶片为材料,分离了2个WRKY基因,分别编码344个和371个氨基酸,与GenBank数据库中的TaWRKY74基因高度同源,命名为TaWRKY74-c和TaWRKY74-d。蛋白质保守结构域分析表明,2个基因都含有1个WRKY保守结构域,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族。定量PCR分析表明TaWRKY74-c和TaWRKY74-d在小麦的叶片、花和茎中均表达,且在茎中的表达量最多,在花中的表达量最少。采用Genevestigator转录组分析工具,对基因在331种环境条件(如逆境、病害、激素等刺激)、10个发育时期(如苗期、孕穗期等)和21种组织器官(如根、花、叶等)中的表达进行了分析,结果表明,该基因在小麦不同发育时期和组织器官中都有表达,且在植物遭受低温、病原体侵染等环境因子处理下,表达量发生显著改变,预示可能参与到这些生物学过程中。采用RT-PCR的方法对上述分析结果进行验证,结果表明生物学实验与生物信息学预测的结果一致。本研究将大量小麦转录组的数据应用到WRKY基因功能分析上,深化了对小麦WRKY基因家族成员功能的认识,为今后对该基因的表达分析和功能研究提供了重要线索和方向。     

刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:(1)刺五加MDD基因cDNA序列全长1 769bp(GenBank登录号为JQ905594),开放阅读框全长1 263bp,编码420个氨基酸残基,包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列;刺五加MDD蛋白的二级结构中含有161个α螺旋,占38.33%;68个延伸链,占16.19%;19个β折叠,占4.52%;172个无规则卷曲,占40.95%;刺五加MDD蛋白无跨膜区域,定位于膜外。(2)刺五加MDD基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。在整个生长期中,MDD的表达呈现高-低-高-低的变化趋势,第一个表达高峰出现在萌芽期至叶片完全展开时,第二个高峰出现在果实体积快速增长期,最高表达量(叶片完全展开期)为最低表达量(叶片衰老期)的4.51倍;不同器官中,幼茎的表达量最高,为最低表达量(叶片)的7.22倍,但叶片、叶柄和根中的表达量差异不显著。研究结果为阐明刺五加皂苷的生物合成及对其进行表达调控奠定了基础。     

水稻WRKY转录调控因子研究进展

WRKY转录调控因子是植物中最大的转录调控因子家族之一,包含1或2个大约由60个氨基酸残基组成的高度保守的WRKY结构域。WRKY结构域的N端有严格保守的WRKYGQK氨基酸序列,其C端有锌指结构模型Cys(2)-His(2)或Cys(2)-His Cys。WRKY转录调控因子与靶基因启动子区域的DNA序列(T)TGAC(C/T)(W盒)特异性结合,调节目的基因的表达,在调控植物生长发育、物质代谢、抗病耐逆及氧化衰老过程中起重要作用。我们就有关水稻WRKY转录调控因子的结构分类及其生物学功能的研究进展做简要综述。     

枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本试验利用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从宁夏枸杞宁杞1号花药中克隆了一个14-3-3蛋白家族基因Lb14-3-3c。利用荧光定量PCR技术分析Lb14-3-3c基因在花药发育不同时期的表达特征,构建Lb14-3-3c基因的植物过表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(+)及植物抑制表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(-),继而经农杆菌介导法将过表达载体转化马铃薯紫花白幼茎,获得了阳性转基因马铃薯植株。结果表明,Lb14-3-3c基因编码的蛋白与番茄处于进化树同一分枝上,亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,该基因在枸杞各器官都有表达,在雄蕊中的表达量最高。在花药发育的各个时期均表达,且在小孢子母细胞时期表达量最高。成功将外源基因Lb14-3-3c载入含强启动子CaMV35s的植物表达载体中,并将该基因的植物过表达载体转化马铃薯,通过表型观察与PCR阳性鉴定得到5株转基因植株,发现转基因植株长势优于野生型植株,苗期野生型与转基因型淀粉含量相差不大,结薯期和成熟期转基因型马铃薯的叶片淀粉含量均高于野生型,且差异显著。本研究为进一步探讨Lb14-3-3c基因对枸杞花药发育过程中淀粉供能的调控提供了参考依据,并且为阐明Lb14-3-3c基因在植物发育过程中的功能及枸杞的分子遗传改良提供了研究基础。     

枸杞LbSPL6基因的克隆及表达分析

从实验室前期对枸杞(Lycium barbarum L.)花发育过程转录组测序结果推测,枸杞Squamosa启动子结合蛋白(Squamosa promoter binding protein-like, SPL)转录因子可能在枸杞花发育过程中发挥重要功能。该研究以宁夏特色植物资源枸杞为材料,采用RACE方法克隆LbSPL6基因,通过生物信息学及基因表达分析对该基因进行初步研究。结果表明:(1)成功克隆获得LbSPL6基因,其开放阅读框全长1 524 bp,编码507个氨基酸,分子量为55.34 kD;序列分析表明LbSPL6蛋白中包含3个保守基序,且氨基酸序列与茄科植物同源蛋白的氨基酸序列高度相似。(2)qRT-PCR分析证实,LbSPL6基因在枸杞花器官中表达,并且在花药发育的四分体时期及单核花粉时期表达量较高;亚细胞定位实验证明,LbSPL6蛋白定位于细胞核中。该研究结果为进一步研究枸杞LbSPL6转录因子在花发育过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

枸杞花药发育基因LbMS2的克隆及表达分析

MS2(Male sterily2)类基因编码脂肪酰基还原酶,参与了花药绒毡层中脂类代谢过程。该研究以宁夏枸杞(‘宁杞1号’)为试验材料,采用RACE方法从枸杞花药cDNA中获得枸杞LbMS2基因。结果显示,LbMS2基因开放阅读框为1 782bp,编码593个氨基酸,等电点为8.98;生物信息学分析显示,LbMS2蛋白定位于叶绿体;LbMS2蛋白序列与茄科植物矮牵牛、茸毛烟草、马铃薯、番茄以及甜辣椒中的MS2蛋白表现出较高的序列相似性;实时荧光定量PCR结果显示,LbMS2基因具有器官表达特异性,只在枸杞花器官中表达,并且在枸杞花药发育的四分体时期以及单核花粉时期表达量最高。研究表明,LbMS2基因是枸杞花器官发育过程中的重要基因。     

橡胶树转录因子HbWRKY9的克隆与特性分析

通过RACE技术克隆得到一个新的橡胶树WRKY,命名为Hb WRKY9,Gen Bank登录号为JQ914653,基因全长为1 646 bp,ORF为954 bp,编码317个氨基酸。Hb WRKY9蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,与蓖麻(Ricinus communis)、麻疯树(Jatropha carcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)和酿酒葡萄(Vitis vinifera)的WRKY成员一致性分别为80%、79%、70%和63%。对其启动子序列的分析表明,启动子核心区域位于翻译起始密码子上游74~123 bp处,启动子序列中包含TATA-box、CAAT-box、5'UTR Py-rich stretch、WRKY转录因子结合位点W-box、MYB结合位点MBS,以及与光响应相关的调控元件G-box和Box4,分生组织特异表达调控元件CCGTCC-box,与缺氧诱导相关的ARE元件,与高温胁迫相关的调控元件HSE,与Me JA和ABA等激素响应相关的CGTCA-motif和ABRE等顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,Hb WRKY9基因能响应低温胁迫,呈上调表达。     

铁皮石斛DoWRKY6转录因子基因的克隆与分析

目的:植物生长发育由多种转录因子调控,探索WRKY转录因子调控铁皮石斛组织生长发育机理。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的WRKY6序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛幼苗根、茎、叶等组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个1,238bp的Ⅱ类WRKY转录因子基因,命名为DoWRKY6,其ORF长1,017 bp,编码339个氨基酸残基,与梅[PrmuWRKY27(XM_008236601.1)]及大豆[GlmaWRKY27(XM_003555347.3)]有较近的亲缘关系,且DoWRKY6在茎中的相对表达量最大。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoWRKY6基因对根、叶、茎的调控作用依次增强,表明DoWRKY6与已发表的铁皮石斛WRKY基因在组织的差异性表达上有较大差别,这对丰富WRKY家族对铁皮石斛的生长发育调控机制提供更多依据。     

枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060bp,其中,ORF开放阅读框为1 044bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90%;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15d达到最高。在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反。相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平。研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用。该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础。     

西葫芦CpWRKY2基因的分离、鉴定及其对非生物胁迫分析

为了解西葫芦(Cucurbita pepo)的WRKY2的功能，通过转录组测序技术从叶片中分离到1条长度为1 071 bp的c DNA，并对其进行序列分析。结果表明，该序列包含1个840bp的开放读码框，预测编码279个氨基酸，与中国南瓜(Cucurbita moschata,XM＿023091218.1)的WRKY核苷酸序列相似性为98.51%，命名为CpWRKY2 (GenBank登录号:XM＿023676898.1)。CpWRKY2定位于细胞核内，CpWRKY2蛋白包含有1个保守的WRKY结构域(第201～267位)，206～266位为WRKY蛋白DNA结合区域，锌指结构域(第232～264位)为C2H2型，且含有1个保守RTGHARFRRAP (第76～86位)氨基酸序列，属于典型的Ⅱd亚类WRKY家族蛋白。CpWRKY2基因上游启动子区域(ATG前的1 513 bp的序列)含有ARE、ABRE、MBS、TCrichrepeat和W-box等可能的胁迫响应顺式作用调控元件。CpWRKY2具有组织表达特异性，在花中表达量最高，其次为根和茎，在叶片和果实中的表达量较低。经5℃、10...     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

白桦开花位点Flowering Locus T（FT）基因的分离及其表达

FT及其同源基因在促进植物成花和发育阶段转变过程中起重要作用。应用RT-PCR和RACE技术分离了白桦FT基因的cDNA,全长为928 bp,其开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸。预测的蛋白质分子量为19.6 kDa,理论等电点为7.73。该预测蛋白序列含有保守的PEBP蛋白结构域,命名为BplFT,并在GenBank注册,登录号为JQ409561。该基因序列同其它16种植物的相似性为74%～93%,其中与无花果（Ficus carica）的相似度最高为93%,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的相似度最低为74%,并构建了该基因序列的进化树。通过qRT-PCR的方法检测BplFT基因在白桦不同时期不同组织中的转录表达,在营养器官的表达高于花器官,成熟组织要高于幼嫩的组织,在成熟茎中的表达量最高,推测BplFT基因在成熟的营养器官发育中起重要作用,并可能参与调控次生细胞壁的形成。另外,选择了白桦雄花序突变体进行该基因的转录表达分析,该基因在突变体雌花序、雄花序、幼叶及幼茎中均为上调表达,预示着BplFT基因不仅仅参与营养组织发育,在花器官发育中也具有一定的作用。     

滇龙胆GrWRKY5基因的克隆和植物表达载体构建

WRKY蛋白是目前被广泛研究的一类DNA特异结合转录因子,在植物次生代谢物生物合成、植物生长和发育及衰老等生理过程以及生物、非生物防御反应中起重要的调控作用。该研究从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成的关键转录因子基因Gr WRKY5,并利用生物信息学方法对基因功能进行预测,构建植物过表达载体。结果表明:根据三年生滇龙胆转录组Gr WRKY5基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增Gr WRKY5 ORF序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建入门载体p ENTRTM2B-Gr WRKY5,经LR反应后构建植物过表达载体。Gr WRKY5 ORF全长591 bp,编码196个氨基酸,Gen Bank登录号为KF922375,其中第167与170之间的色氨酸(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)组成WRKY蛋白所特有的"WRKY"结构。序列分析表明Gr WRKY5是WRKY超家族的成员。经生物信息学在线软件分析发现,Gr WRKY5的等电点为6.29,脂肪族指数为61.37,不稳定指数为57.80。总平均疏水性为-0.708,为亲水蛋白;含有20种氨基酸,其中天冬氨酸(Asp)和脯氨酸(Pro)含量最高,为8.1%;半胱氨酸(Cys)含量最低,仅为1.0%。氨基酸序列系统发育分析表明,Gr WRKY5与拟南芥中WRKY家族中遗传距离最接近的是WRKY27,属于Ⅱe类成员;与Cr WRKY22和Vv WRKY22蛋白的亲缘关系较近;与Jc WRKY47和Tc WRKY27亲缘关系较远;BLASTp结果显示,Gr WRKY5与欧洲油菜Bn WRKY27-1的同源性最高(为69%);与拟南芥Aa WRKY22的一致性最低(仅为31%)。以Gateway入门载体p ENTR2B和目的载体p K2GW7为基础,成功构建了植物过表达载体p K2-35S-Gr WRKY5,该载体的成功构建为该基因在拟南芥、滇龙胆等植物中的遗传转化奠定了基础,同时为WRKY基因功能的深入研究提供依据。     

拟南芥WRKY2转录调控因子可能参与调控渗透胁迫反应

拟南芥WRKY2蛋白定位于细胞核,表明WRKY2是转录调控因子。WRKY2在不同器官组织中的表达分析显示在叶的表达量是最高的。在各种逆境条件下的表达分析显示：WRKY2的表达受NaCl和甘露醇比较强的诱导;KCl、LiCl、CaCl2和NaH2PO4均不诱导WRKY2的表达;ABA处理基本上不影响WRKY2基因的表达;另外,WRKY2的表达也不受病原菌、冷害和高温的诱导。这些结果表明WRKY2可能在NaCl和甘露醇引起的渗透胁迫反应中起一定的作用。     

宁夏枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的cDNA克隆及其表达分析

为探讨宁夏枸杞(Lycium barbarum)苯丙氨酸解氨酶基因(LbPAL)的表达特征,采用PCR法克隆了宁夏枸杞LbPAL基因的cDNA,并用实时定量PCR法分析了其表达特征。结果表明:宁夏枸杞的LbPAL基因的全长cDNA为2321 bp,包含2163 bp、编码720个氨基酸的开放阅读框;LbPAL与茄科其他物种的PAL氨基酸序列及三维结构具有较高保守性;与茄科物种的PAL聚类在同一个分支中。LbPAL在叶、花瓣、S1期果实的表达量较高,而在根及S2~S5期果实的表达水平较低。在NaCl胁迫处理下,LbPAL在根和茎中的表达量均有下调的趋势;而在叶片中,LbPAL表达量先急剧增加而后急剧下降并趋于稳定。这为解析宁夏枸杞中类黄酮化合物的生物合成调节及生理功能提供了参考。     

枸杞液泡膜H^+-转运焦磷酸酶基因LbVP1克隆及表达分析北大核心CSCD

液泡膜H^+-转运焦磷酸酶在调节植物生长发育和逆境胁迫应答中发挥重要作用。本研究在已构建的枸杞本地数据库中先进行VP基因电子克隆,然后结合RT-PCR方法克隆到一个枸杞液泡膜H^+-转运焦磷酸酶编码基因LbVP1,并对其序列结构、时空表达模式进行了初步分析。LbVP1开放阅读框全长2301 bp,编码766氨基酸残基。多序列比对显示该基因与拟南芥AVP基因相似性达87.9%,序列结构生物信息学预测和亚细胞定位实验表明,该基因具有液泡膜H^+-转运焦磷酸酶的保守结构域和跨膜区,可能在液泡膜发挥作用。荧光定量PCR结果显示,LbVP1在花、叶和不同发育阶段果实中存在时空表达差异,干旱胁迫处理下叶片和果实中该基因表达量与对照存在(极)显著差异(P<0.01,P <0.05)。研究结果将为阐明该基因在枸杞抗旱分子调控机制中的作用提供基础理论依据。     

牡丹PsAGL6基因克隆与表达分析

该研究在转录组数据分析基础上,通过RT-PCR方法从牡丹(Paeonia suffruticosa.L)品种‘洛阳红’中克隆AGL6基因,并分析了其在不同组织和花型中的表达模式。结果显示:(1)AGL6开放阅读框长度732bp,编码244个氨基酸;结构域分析显示,该基因具有高度保守的MADS MEF2区、K区、AGL6I与AGL6II基序,归类于MADS-box基因家族,命名为PsAGL6,GenBank登录号为MF563611。(2)同源比对分析显示,牡丹PsAGL6与葡萄VvAGL6氨基酸序列相似度最高,达79%。(3)qRT-PCR分析结果显示,PsAGL6在牡丹各器官中均有表达,但营养器官中表达量较低,花器官中表达量较高,其中以萼片最高,花瓣与雌蕊次之;对4种牡丹花型花瓣的表达分析显示,PsAGL6基因在不同花型花瓣中的表达量差异明显,且蔷薇型牡丹花瓣相对表达量最高。研究表明,AGL6基因参与牡丹花器官的形成,为深入研究花器官发育的分子机制提供了帮助。