马铃薯根结线虫抗性基因的电子克隆与序列分析

近年来,马铃薯受根结线虫的危害日益严重,造成减产、植株萎蔫、影响其商品性,并使其很容易受其他土传病害侵染。而不同马铃薯材料对根结线虫抗病性存在明显差异。因此,从分子角度挖掘和利用其本身所具备的抗病基因变得尤为重要。本研究采用电子克隆技术,搜索马铃薯EST数据库,拼接获得28 714条重叠群(contigs),以番茄、辣椒中已经克隆的根结线虫抗性基因作为探针,与所拼接的contigs进行比对及序列分析,共获得2条马铃薯根结线虫抗性基因的c DNA序列(contig_5164,contig_12247)。进一步采用生物信息学方法,对所得2条抗性基因序列进行了氨基酸组成和亲缘关系的分析。结果显示,contig_5164总长1 191 bp,推测编码206个氨基酸,等电点为4.77。Contig_12247总长892 bp,推测编码114个氨基酸,等电点为4.24。氨基酸组成均以亮氨酸最多,谷氨酸其次。两基因与番茄亲缘关系最近。随后对拼接所得contigs进行功能注释和GO分类,完成了对马铃薯中5类抗病保守结构域基因的挖掘。本研究的结果可为马铃薯根结线虫抗性基因进一步的研究与应用以及开发利用马铃薯抗性资源奠定基础。     

基于EST数据的水稻基因表达大规模初步分析

EST序列代表了组织基因表达的转录信号,本研究尝试开发简单高效的大规模EST分析方法,从NCBI下载水稻(Oryza sativa)的所有EST序列并进行分析以获取水稻发育过程基因表达的重要信息。通过进行blast比对和phrap拼接分析,及利用Unix文本过滤方法,从EST序列拼接获得了3万多个重叠群序列。进一步将重叠群序列与NCBI核酸数据库进行比对获得了各个序列的注释信息。从重叠群的组织表达初步挖掘中发现花药的表达数量最多,为下一步探讨水稻发育器官特异表达基因调控打下了重要基础。     

青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

基于454测序技术的青藏高原黄绿蜜环菌微卫星引物的开发

【目的】本研究利用454焦磷酸测序技术,对青藏高原黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)转录组进行测序,从获得的Expressed sequence tags(EST)序列中开发EST-SSR引物。【方法】利用高通量测序获得的EST序列设计微卫星引物,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳检测筛选出合格的微卫星引物。【结果】共得到了1997121条reads,总数据量超过80Mb,序列平均长度为449bp。对于所获得的reads进行拼接后得到了22236条非冗余的EST序列,其中含有2024条contigs(平均读长974bp)和20212条singletons(平均读长404bp)。在所有序列中共找到321条符合条件的含有SSR的序列,从中随机选择98对,成功开发出27对具有多态性条带的微卫星引物。利用采集自3个不同居群的66个个体对上述27对引物进行验证,有17对引物符合Hardy-Weinberg平衡且没有连锁不平衡现象。【结论】首次成功利用高通量测序技术开发的EST-SSR引物将会对今后黄绿蜜环菌遗传多样性的研究以及种质资源鉴定、遗传图谱构建等打下了坚实基础。     

家蚕母性基因的表达序列标签分析

为了研究家蚕Bombyx mori卵中储存的母性遗传信息,以未受精的肾脏型和正常型蚕卵为材料构建了cDNA文库,并对其随机测序,共获得391条表达序列标签(EST)序列,经拼接后得到374条非重复序列。生物信息学分析发现,172个非重复序列与国际数据库GenBank和silkbase中的已知基因具有较高的相似性。除3个已知母性基因外,其余主要与DNA复制、能量代谢、信号转导、转录、蛋白质结构以及胚胎发育中个体形成等相关。该结果可为进一步研究家蚕胚胎早期发育的调控提供基础数据。     

泌乳前后家猪乳腺基因表达谱的构建以及不同猪种和不同发育时期差异表达基因的确定

构建了不同猪种、不同发育时期的非标准化家猪乳腺cDNA文库, 并从中获得28941条高质量ESTs (expressed sequence tags). 利用序列拼接软件CAP3, 这些EST序列被拼接成2212条重叠群和5642条单一序列. 这些序列在经过功能注释后被聚类成6857个基因聚类, 其中2072条无相应功能注释的序列被认为来自于新基因. 按照标准基因词汇体系的分类标准, 已经有功能注释的基因进行了聚类分析. 通过比较基因表达谱, 确定了几组在猪种间和猪种内不同发育时期乳腺中差异表达的基因, 这些基因中某些可能与家猪的繁殖特性相关, 另外则在乳汁合成、分泌和乳腺复旧过程中发挥重要的作用. 这些来源于家猪乳腺特定发育时期的基因表达谱和一些功能未知的EST序列为进一步的研究提供了重要资源.     

抑制差减杂交分离赤霉病菌诱导的小麦特异表达基因

为了全面探索小麦赤霉病抗性机理,以抗赤霉病小麦品种‘苏麦3号’及其感病的近等基因系(Hwo4)为实验材料,构建了一个‘苏麦3号’受赤霉病菌诱导表达的正向差减杂交文库。随机选取了141个阳性克隆测序,共获得133条通读EST。将获得的EST去除载体及接头序列后,利用CAP3软件进行聚类分析,133条EST被聚成90个序列重叠群(contigs),片段大小介于106~643 bp间,平均长度为274 bp。利用NCBI的Blastx软件对序列进行蛋白序列同源性比对,结果显示76条序列在蛋白数据库中可以找到同源序列,功能涉及能量代谢、物质代谢、疾病/防御、转录及细胞结构等。其中以能量及物质代谢相关的基因数量最多,分别占总EST的21.1%及17.1%;其次是与抗病及防御反应有关的EST,数量占总EST的15.8%。进一步的分析表明与抗病及防御相关的EST功能主要涉及抗氧化、细胞解毒及相关物质的代谢。     

意大利蜜蜂工蜂中肠SNP和InDel突变位点的挖掘及分析

本研究利用已获得的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的转录组数据对意蜂的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion, InDel）突变位点进行挖掘和分析,共鉴定到232 678个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点数分别为196 087和36 591个;最丰富的突变类型是G/A,最少的突变类型为T/G;分布在内含子的SNP位点最多,其次为外显子和基因间区;密码子突变类型为同义突变的SNP位点数最多,其次是非同义突变、终止子增加和终止子减少;此外,SNP位点所在基因可注释到 50个 GO条目和351条KEGG通路。共鉴定到38 715个InDel位点,最丰富的突变类型为移码插入,其次是移码缺失;分布InDel位点数较多的基因组区域为内含子和基因间区;另外,InDel位点所在基因可注释到50个功能条目和340条通路。研究结果丰富了西方蜜蜂Apis mellifera的SNP和InDel位点信息,并为开发和利用意蜂的新型分子标记提供基础。     

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用.本研究将该基因序列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA:该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp,编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19 6 kDa,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达.     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺表达序列标签(EST)分析

以日本七鳃鳗口腔腺为材料,构建库容量为2.1×106pfu/mL的cDNA文库。通过对文库中克隆子的序列测定和生物信息学初步分析,得到1323条有效EST序列。经BlastX及BlastN软件进行同源对比分析,653条(49.36%)EST可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源序列,其中328条与七鳃鳗科物种同源。同源序列功能分类大致分为11类,与蛋白质合成有关的蛋白所占比例最大。1323条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)获得包括547条序列在内的162组片段重叠群并确定了8条全长cDNA。日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库以及EST文库的成功构建,为研究日本七鳃鳗口腔腺的功能基因和蛋白质组学奠定了基础。     

日本沼虾ITS1序列分析及SNPs位点的筛选

研究采用直接测序法,分析日本沼虾(Macrobrachium nipponense)rDNA基因内转录间隔区ITS1的DNA序列,以筛选日本沼虾SNPs位点。共分析了32个太湖水域野生日本沼虾样本,结果表明,日本沼虾ITS1序列平均长度为1749.8bp,是迄今已报道的最长的ITS1序列,A、G、T和C的平均含量分别为29.9%、28.3%、27.7%、14.0%,G+C的含量平均为42.3%。通过序列比对,共筛选出22个SNPs位点,SNPs位点出现频率为0.0126,其中9个为C/T转换(占40.91%),4个为A/G转换(占18.18%),2个为A/T颠换(占9.09%),5个为T/G颠换(占22.73%),1个为A/C颠换(占4.55%),1个A/T或C颠换(占4.55%)。日本沼虾ITS1序列的22个SNP位点中,21个位点为2个等位基因,1个位点出现了3个等位基因,为复等位基因位点。日本沼虾ITS1序列中还发现3个具有多态性的微卫星位点、1个高度变异区以及大量的缺失、插入。研究首次对日本沼虾ITS1序列进行了分析,并发现了大量的SNP位点,为日本沼虾遗传育种研究提供了新的分子标记。       

桉树EST序列中微卫星含量及相关特征

通过对桉树属(Eucalyptus)的10 000条EST序列进行分析, 在其中的1 499条序列上共发现1 775个微卫星重复序列。含有微卫星的EST序列约占序列总数的15%。此外, 还发现桉树EST序列所含微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关; 微卫星的丰度与重复单元长度也呈负相关(三碱基重复微卫星除外)。在桉树EST序列中, 重复单元长度为三碱基的微卫星最为丰富。三碱基重复单元微卫星的过度富集可能是由于遗传密码选择所致。在微卫星的丰度及长度变异方面, 桉树EST序列与杨树(Populus trichocarpa)基因组注释的转录序列随重复单元长度的变化呈现出相同的规律, 但桉树EST序列中微卫星频率及三碱基重复微卫星的含量显著偏低, 推测含微卫星的基因表达丰度极有可能低于不含微卫星的基因。通过对发现的所有微卫星位点进行引物设计, 并对设计的引物进行PCR检测, 结果表明所设计的引物具有极高的扩增成功率。     

朝仓花椒幼芽转录组测序数据组装及基因功能注释

采用2代Illumina Hi-Seq测序技术对朝仓花椒雌株结果期幼芽的转录组进行测序,构建了转录组数据库,获得49 672 080条Clean Reads数据,包含总长度为4 967 208 000 nt序列数据信息;经拼接组装,获得转录组基因信息长达55 902 243 nt的176 407个Contig片段,再通过进一步拼接,共获得平均长度为878 nt的96 475个Unigene片段。与Nt、Nr、Swiss-Prot、COG、GO、KEGG等数据库进行BLAST信息比对(E-value艽10-5),共获得68 315个注释基因,以及62 150个表达序列标签(EST)。与NR数据库比对,发现花椒转录组基因序列与同科柑橘属的甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Citrus clementina)具有较高的同源性,分别为43.96%及41.86%,与其他物种的同源性较低,均不足10%;可将花椒转录组的Unigene的功能通过与COG数据库进行注释比对划分为25类;根据GO数据库的注释,可将其分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类共55分支,根据与KEGG数据库的比较分析发现朝仓花椒的转录组数据中含有代谢通路相关基因128类,其中包括多种化合物的代谢途径和次生代谢产物的生物合成途径,其中有较多的次生物质代谢途径,如萜类化合物生物合成途径、黄酮类生物合成代谢途径以及花青素的生物合成途径等。     

中华蜜蜂的单核苷酸多态性和插入缺失突变位点鉴定

【目的】本研究拟利用已获得的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫肠道的转录组数据对单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion,InDel）突变位点进行挖掘和分析,旨在丰富中华蜜蜂的SNP和InDel信息,并为新型分子标记的开发提供基础。【方法】根据有效读段与东方蜜蜂Apis cerana参考基因组的比对情况,采用GATK软件识别单碱基错配和碱基的插入缺失情况,再利用ANNOVAR软件对SNP位点和InDel位点进行分析。通过相关生物信息学软件将SNP和InDel位点所在基因分别比对GO和KEGG数据库,以获得相应的功能和通路注释。【结果】共鉴定到中华蜜蜂的58 919个SNP位点,包括24 548个纯合位点和34 371个杂合位点;发生转换和颠换的SNP位点分别有49102和9817个;数量最多和最少的突变类型分别是C/T和T/G;分布在外显子区的SNP位点数量最多,达到22 649个;此外,发生同义突变的SNP位点数量最多,其次是非同义突变;SNP位点所在基因可注释到46个GO条目和121条KEGG通路。共鉴定到6 551个InDel位点,包括3 270个插入突变和3 281个缺失突变;分布在内含子区InDel位点最多,共计2 793个;发生移码插入的InDel位点最多;进一步分析结果显示InDel位点所在基因可注释到27个GO条目和28条KEGG通路。【结论】本研究鉴定到中华蜜蜂的大量SNP位点和InDel位点,解析了SNP和InDel位点的突变类型、基因组功能元件分布和密码子突变类型,并揭示SNP和InDel位点对中华蜜蜂的重要生物学过程具有潜在影响。     

红鲫部分线粒体DNA序列变异分析

对红鲫19尾个体的线粒体tRNA-Thr基因、tRNA-Pro基因和部分控制区的核苷酸序列进行了测定．获得19条长度为836～837bp的同源基因序列,共发现18个变异位点．定义了4种单元型．在红鲫4种单元型中确认了DNA复制终止相关的序列TAS、中央保守区序列（CSB-F、CSB-E和CSB-D）和保守序列CSB1．在18个变异位点中,除一个缺失外,序列变异全部为转换,无颠换发生．4种单元型之间的序列差异在0．1％。1．7％之间．结果显示,红鲫群体具有较高的遗传多样性水平,因而暗示了它具有较强的适应外界环境变化的能力,同时说明它是鱼类遗传育种的较好实验材料．     

木麻黄EST序列中SSR的分布特征及有效SSR标记的筛选

从NCBI的EST数据库中获得的木麻黄EST序列共有34 752条,进行拼接后得到全长7 278.578 kb的非冗余序列(Unigene)12 062条,并从中检索得到分布于353条Unigene的367个SSR位点,SSR检出率为2.93%,平均分布距离为19.83 kb,包括39种重复基序类型。其中,以二核苷酸和三核苷酸为主要类型,在总SSRs中所占比例分别为57.77%和34.60%;而二核苷酸重复基序中,AG/CT所占比例最高,为93.87%;在三核苷酸重复基序中AAG/CTT所占比例最高,为44.09%。对检索出的EST-SSR位点设计得到97对引物,其中32对为可有效扩增引物。Blastx分析发现77.3%的含SSR位点的EST序列与非冗余蛋白序列数据库中功能序列具有同源性,而功能已知的序列中葡萄来源的序列占有最大比例(10.4%)。GO功能分类发现,含有SSR位点的EST序列中有47.3%至少具有1个GO注释,归入细胞组分的序列最多,而其中细胞质和细胞核的功能项所占比例较大。     

黄花蒿rbcL基因电子克隆、生物信息学及适应性进化分析

[目的]运用电子克隆的方法获得黄花蒿中rbc L基因,并对该基因进行生物信息学及适应性进化分析,获得氨基酸正选择位点及其空间结构特征。[方法]以短葶飞蓬rbc L基因为种子序列(探针,Genbank登录号为:KF482865.1),对黄花蒿的EST数据库进行搜索,应用相关的生物软件进行拼接、组装,利用PAML程序检测其rbc L基因的适应性进化。[结果]获得一个rbc L基因的c DNA序列重叠群,该重叠群长为1 832bp,包含一个完整的长为1 461bp的开放阅读框,共编码486个氨基酸,且与菊科的其他植物的rbc L基因具有较高的同源性,适应性进化分析在rbc L蛋白上有两个氨基酸正选择位点(249S和449T)。[结论]电子克隆获得的c DNA序列为完整的黄花蒿rbc L基因全长c DNA,黄花蒿对生境的适应可能与rbc L蛋白大亚基正选择位点空间结构有关。     

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot-gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad-Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs问的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析’VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNA pol)基因的进化树分析。结果：VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G C含量为50．56％,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNA pol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp-1和芽孢杆菌噬菌体GA-1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。     

梅花鹿鹿茸尖端组织ESTs分析

文章通过对东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)鹿茸尖端组织cDNA文库随机测序获得了906条高质量ESTs,906条ESTs拼接后代表了701个Unigenes,其中包括重叠群86个,单拷贝615个。Blast分析显示具已知和推测功能的基因580个(82.7%),通过Gene Ontology(GO)分类对获得的580个功能基因进行了包括分子功能、生物过程和细胞组分在内的3个层次的功能注释,并根据BLAST的注释结果及进一步的筛选与分析,共得到39条与鹿茸尖端组织生长发育相关的基因。cDNA文库的构建和ESTs分析填补了鹿科动物在NCBI公共数据库上基因组信息的空白,并为科学的开发和利用梅花鹿资源提供了重要的理论依据。     

长白落叶松群体4CL基因单核苷酸多态性分析

以黑龙江省林口县青山林场21年生长白落叶松（Larix olgensis Henry）异地保存种为材料,利用SNP标记方法和DNAMAN软件分析白刀山种源子代林的单核甘酸多态性情况。从分子水平证明长白落叶松具有丰富的遗传多样性,用4CL-A引物检测到178个SNP多态位点。共测序240条EST序列,测序成功193条,测序成功率为80.42%。本研究178个SNP变异中,有126个属于转换类型,占总变异的70.79%;有52个属于颠换类型,占总变异的29.21%,变异类型符合,转换∶颠换=7∶3。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占37.08%和33.71%;颠换类型中G/C、A/C、A/T、和G/T分别在占7.87%、8.99%、7.87%和4.99%。但每个家系内的转换和颠换的比例相差较大,没有规律。转换和颠换的比例最大的是554号家系,其比值为7∶1,最小的家系是855号家系,其比值为3∶4。