Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化

为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中,重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/m L;在此基础上对重组菌发酵条件进行优化,通过单因素实验(氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)和正交实验(氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为:氮源(工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1)48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0,最适培养温度为30℃;在此条件下,MTSase的酶活可达41.5 U/m L,是优化前的2.4倍。     

重组菌BL21-HTa-cgkZ产κ-卡拉胶酶的发酵条件优化

【目的】优化重组菌BL21-HTa-cgkZ产生κ-卡拉胶酶的发酵条件。【方法】通过单因子筛选和响应面分析方法对在IPTG诱导下的κ-卡拉胶酶的产生菌BL21-HTa-cgkZ进行产酶条件优化。【结果】该菌产酶的最佳培养基组成为：乳糖7 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,CaCl2 0.666 g/L。最佳诱导条件为：在工程菌接种1.55 h后添加IPTG,IPTG的浓度为0.89 mmol/L,诱导时间为24 h,诱导温度为23.03 °C。并确定了在培养基中添加乳糖、Triton X-100对κ-卡拉胶酶分布的影响。【结论】实验结果为产κ-卡拉胶酶工程菌的规模化生产奠定基础。     

产β-葡聚糖酶基因工程菌发酵条件的优化

目的以1株酶产量高、耐热性好的重组大肠埃希菌BL21为材料发酵生产β-葡聚糖酶。方法选用麸皮、豆粕等农副产品配制复合碳源、氮源,优化半合成发酵培养基,并通过正常试验确定最佳培养条件。结果研究得到摇瓶水平产β-葡聚糖酶的最佳培养基（g/L）为：麸皮6.7,玉米粉1.7,豆粕13.8,豆粉13.8,酵母粉7.0,NH4Cl 7.0,Na2HPO4.12H2O3.0,MgSO4.7H2O0.75,CaCl20.5,吐温80 0.8%。通过正交试验确定了产酶最佳初始pH为6.2,装样量为35 mL/250 mL,接种量为1%。采用优化后的工艺,在37℃200 r/min培养过夜,经乳糖诱导6 h后,最高酶活可达到830.7 U/mL,是初始产酶条件的3.4倍。结论该半合成培养基在重组大肠埃希菌产β-葡聚糖酶方面具有很大优势。     

响应面法优化洋葱假单胞菌产脂肪酶液体发酵工艺

用响应面法对洋葱假单胞菌G-63液体发酵产脂肪酶条件进行了优化。首先运用单因子试验筛选出麦芽糖和豆粉水解液为最适碳源和氮源。在此基础上,通过Plackett-Burman设计试验,对影响产酶条件的11个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的3个因子:橄榄油、豆饼粉水解液以及初始pH值。在用最陡爬坡实验逼近以上3个因子的最大响应区域后,采用响应面分析法,确定出橄榄油、豆粉水解液的最佳浓度和最佳初始pH值分别为4.337%,1.956%和8.38。优化后液体发酵培养基中脂肪酶活力提高到44.39 U/mL,比初始酶活13.45 U/mL提高了3.3倍。     

Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶可溶性表达及产酶条件优化

【目的】克隆Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶的编码基因(alanine dehydrogenase),转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)中构建可溶性表达alanine dehydrogenase(ald)的工程菌CZR07并优化产酶条件。【方法】提取A.ureafaciens CZ31菌株的全基因组DNA,设计引物扩增出ald基因,与pET-28a连接后导入E.coli Rosetta中表达并纯化重组蛋白,以单因素实验结果为依据,响应面法优化发酵条件。【结果】ald全长为1119 bp,编码含372个氨基酸残基的蛋白质,分子量约为40 kDa,酶活为2.65 U/mg。响应面分析温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度为IPTG浓度温度温度×IPTG浓度温度×诱导时间IPTG浓度×诱导时间诱导时间。CZR07摇瓶发酵最佳条件为温度22°C、IPTG 0.7 mmol/L、诱导时间7 h,此条件下重组酶酶活达到15.23 U/mg,与响应面优化的预测值相似,较优化前提高5.75倍。【结论】克隆并实现了CZ31中ald基因的可溶性表达,采用BBD法优化产酶的诱导条件,获得显著的优化效果,为其他工程菌株产酶条件优化提供借鉴。     

嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

通过化学方法合成嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶基因ce,将其引入到载体pBSuL3-ce,构建重组质粒pBSuL3-ce并转化进枯草芽孢杆菌,发酵48h后测定胞内酶活为7. 5U/ml。酶学性质结果表明:该酶的最适pH为8. 5;最适温度为85℃,85℃的半衰期为120min。为降低发酵成本,对发酵培养基进行优化:以35g/L豆粕粉为氮源、5g/L甘油为碳源时,酶活力最高可达12. 3U/ml。依据摇瓶优化的条件在3L发酵罐中扩大培养,胞内酶活达到56U/ml,比摇瓶培养酶活提高了8倍。利用发酵所得酶制备乳果糖,在乳糖浓度为400g/L、反应温度为85℃、初始pH 8. 5、加酶量为20U/ml的条件下,乳果糖转化率可达51%。     

响应面法优化嗜热链球菌增殖培养基

目的 为了降低嗜热链球菌工业化生产成本,提高其发酵活菌数,对嗜热链球菌原始培养基的成分进行了响应面优化.方法 利用Design-Expert软件首先采用Plackett-Burman试验设计筛选出了影响嗜热链球菌生长的显著因子,再依据响应面法设计试验,得到嗜热链球菌的优化培养基配比.结果 乳糖、酵母粉和L-半胱氨酸为嗜热链球菌生长的显著性因子;优化后培养基配比由结果分析可知,当活菌数达到最大值时,即:乳糖的浓度为3.6％,酵母粉的浓度为1.74％,L-半胱氨酸的浓度为1.1％,牛肉蛋白胨1％,酪胨1％,KH2PO4 0.20％,Na2 HPO40.20％,叶温-80 0.1％活菌数为最高2.34×109 CFU/mL.结论 采用响应面分析法优化的培养基较经典TPY培养基活菌数提高了近2～3倍.     

argE基因在大肠杆菌中的表达优化

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶可在重组菌BL21（DE3）-pET22b-argE中表达。首先确定了该酶的细胞表达定位,再研究了诱导温度、诱导剂种类及浓度、诱导起始菌体密度、诱导时间等因素对重组菌生长及目的蛋白表达活性的影响。结果表明,IPTG和乳糖皆可诱导目的蛋白表达,乳糖的诱导效果优于IPTG。在诱导起始0D600为0．46时加入15g／L乳糖,20℃诱导18h最适于目的蛋白的活性表达。表达条件优化后,酶活从1．68U／mL提高至282．99U／mL,约为原来的168倍。     

MntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

构建Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌,并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化,确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为:甘油7.0 g/L,酵母粉3.75 g/L和蛋白胨11.25 g/L;当培养基中的Mn2+浓度为1 mmol/L时,最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外,最佳的培养基初始p H值及培养温度分别为:p H 8.0和37℃,在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h,过氧化氢酶活最高可达476 U/m L是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中,过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/m L。     

Optimization of fermentation conditions of xylanase produced by recombinant Pichia pastoris

采用单因素实验确定重组毕赤酵母产木聚糖酶生长相的最适条件,然后利用Plackett-Burman实验设计对诱导相培养基成分和培养条件的10个因素进行筛选,方差分析结果表明,影响木聚糖酶表达的主要因子为酵母膏、诱导pH和摇床转速;在此基础上,用Box-Behnken的响应面方法对3个因素进行进一步优化,当酵母膏为11.13 g/L,pH为6.38,摇床转速为228 r/min时酶活有最大值,为262.77 U/mL,较优化前提高了175.44％.优化后的摇瓶发酵条件应用于7L发酵罐并连续诱导培养120 h,发现诱导72 h后的木聚糖酶酶活最高,为2054.89U/mL.     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

重组大肠杆菌共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶发酵条件优化

在摇瓶中对共表达亮氨酸脱氢酶(Leu DH)和甲酸脱氢酶(FDH)的重组大肠杆菌(E.coli)的发酵条件进行优化。首先考察基础培养基中碳、氮源种类和浓度及初始p H等因素对重组大肠杆菌生长和产酶的影响,实验结果表明甘油和酵母膏为最佳碳源和氮源,最适质量浓度均为10 g/L,培养基最适初始p H为8.0。然后对诱导条件进行优化,确定最适的诱导时机为菌体密度(OD600)达到0.6时,最适的诱导温度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间分别为25℃、0.2 mmol/L和20 h。在优化后的培养条件下,菌体密度(OD600)可达8.6,Leu DH和FDH酶比酶活分别达1 543.3和2 572.4 U/L,是优化前的2.0和3.1倍。     

交替假单胞菌LP621菌株产右旋糖苷酶的培养条件优化

从江苏连云港海域分离和筛选到1株产右旋糖苷酶的海洋细菌交替假单胞菌Pseudoalteromonas tetraodonis LP621,通过单因素试验和正交试验对该菌株产右旋糖苷酶培养条件进行优化。单因素试验结果表明,最佳培养时间为24 h,最适产酶温度为25℃;产酶pH范围为5.0~11.0,最适产酶pH为6.0;产酶NaCl浓度范围为1%~10%,NaCl浓度为4%时产酶较高;装液量在25%。麦芽糖、胰蛋白胨和酵母膏促进产酶。利用响应面方法对LP621产右旋糖苷酶的发酵条件进行优化。选择培养基pH、时间、麦芽糖浓度和装液量4因素进行优化,结果为pH 7.07,发酵时间21.94 h,麦芽糖浓度0.42%,装液量为21.88%,酶活为270.1U/mL。     

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。     

根霉cw-1产纤溶酶的发酵条件优化

目的:确定根霉cw-1高产纤溶酶的液体发酵培养基组成及培养条件,使纤溶酶产量得到明显提高。方法和结果:采用响应面法对该菌种产纤溶酶的发酵条件进行优化。首先利用Plackett Burman试验设计筛选出影响产酶量的3个主要因素,即麸皮的浓度、豆粕的浓度和初始p H。在此基础上使用Design-Expert软件进行Box-Behnken试验设计,通过响应面分析得出菌株cw-1发酵产酶的最佳条件为:麸皮28.67g/L、豆粕46.28g/L、初始p H 5.8。经过试验验证,优化后粗酶液酶活达到243.22 U/m L(尿激酶单位),与响应面预测结果一致,较优化前酶活提高41倍。     

乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达

以构建好的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/xylanase为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组蛋白的表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,乳糖作为诱导剂时,重组菌产酶活力33.9 U/mg略高于IPTG作为诱导剂时重组菌产酶活力28.10 U/mg,这为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产木聚糖酶提供了参考依据。     

三种霉菌产纤维素酶能力分析与培养条件优化

对实验室现有3种真菌产纤维素酶能力的分析及培养条件优化。比较了3种菌在刚果红培养基上的透明圈大小、并分析产纤维素酶酶活;通过单因素与响应面分析的方法优化毛酶产纤维素酶的培养条件。通过试验得出3种真菌均能产纤维素酶,毛霉能产较多的纤维素酶。毛霉产纤维素酶的最佳条件为:pH 5.0,转速220 r/min,发酵时间47 h,发酵温度35℃,纤维素酶活为6.99U/mL。毛霉、青霉、曲霉均产纤维素酶,毛霉能降解玉米芯纤维素。     

响应面法优化重组巴斯德毕赤酵母合成ECH42的培养基组分及其重组酶降解几丁质的研究

采用响应面法在摇瓶水平对重组巴斯德毕赤酵母合成内切几丁质酶的培养基组分进行优化,并探讨重组内切几丁质酶降解几丁质的最佳反应条件。首先对培养基中显著影响内切几丁质酶活力的关键组分通过Plackett-Burman试验设计进行筛选;然后通过Box-Behnken试验设计和响应面法确定关键组分的最佳浓度。结果筛选出3个具有显著效应的关键组分为酵母膏、油酸和吐温-80,最佳浓度分别为：2.45%、0.17%和0.62%。优化后的最佳培养基组成为：2.45%酵母膏、2.00%蛋白胨、0.50%酵母氮碱（YNB）、0.50%甲醇、0.17%油酸、0.62%吐温-80和0.40% PTM₁。在该培养基中,重组巴斯德毕赤酵母在摇瓶水平（25mL/250mL）发酵生产内切几丁质酶的活力高达92.26U/mL。重组内切几丁质酶催化几丁质降解的最佳反应条件为：粉末几丁质浓度为4%,pH和温度分别为7.0和30℃,反应时间为10h。研究结果为后期在发酵罐中大规模生产内切几丁质酶和几丁寡糖提供了基础。     

重组大肠杆菌Bgl2238的发酵优化

本研究对前期实验室从黑龙江玉米土壤中筛选并构建的β-葡萄糖苷酶Bgl2238的重组大肠杆菌(E.coliBL21(DE3)-pET32a-bgl2238)采用响应面(Box-Behnken)优化的方法进行摇瓶发酵,优化培养基组分,而培养条件即温度、pH值、接种量及装液量则采用单因素法优化。结果显示最佳培养基配比为:甘油9.32g/L、酵母提取粉12g/L、胰蛋白胨19.13g/L、NaCl8g/L、K_2HPO_4·3H_2O 19.13g/L、KH_2PO_42g/L、柠檬酸高铁胺0.2g/L和微量元素母液6mL/L。重组大肠杆菌Bgl2238最佳的发酵条件为:发酵温度37℃、起始pH8.0、3%接种量、25mL装液量、IPTG终浓度为0.25mmol/L。在250mL锥形瓶对重组子Bgl2238进行发酵,在最优化的发酵培养基成分和培养条件下,Bgl2238的酶活力可以达到2910U/L,比起始培养基中的酶活提高了61.77%。     

乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达

旨在研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件.在摇瓶发酵条件下,通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件,利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,研究以上条件改变对GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较.结果显示,在摇瓶试验中,最优表达条件为选用TB培养基,在菌体对数生长的中期进行诱导,诱导温度37℃、乳糖诱导终浓度3 mmol/L、诱导时间6 h.GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.5％,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同.分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导,效果一样.乳糖可以替代IPTG作为诱导剂诱导GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达,优化条件下可获得与IPTG相同的诱导表达效果.