人热休克蛋白70和热休克固有蛋白70的基因克隆和表达

目的:克隆人热休克蛋白70(HSP70)和热休克固有蛋白70(HSC70)基因,并在大肠杆茵中表达,获得重组蛋白.方法:用RT-PCR法从HepG2细胞中扩增HSP70及HSC70cDNA序列.测序后,将相应的cDNA插入pRSET-A表达载体,在大肠杆菌中表达,重组蛋白纯化后用SDS-PAGE及Western Blotting分析.结果:DNA序列结果显示.本研究所获得的HSP70及HSC70 cDNA序列与参考序列一致.将全长cDNA分别插入表达质粒后,转化BL21(DE3)细菌,在IPTG的诱导下,表达产物SDS-PAGE显示相应的分子量(70kDa)位置有明显的蛋白条带.Western Blotting结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组多肽.结论:成功构建了原核表达重组质粒HSP70-pRSET-A和HSC70-pRSET-A,并获得了纯化的重组人HSP70和HSC70蛋白,为进一步研究这两种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础.     

香烟烟雾和脂多糖对大鼠肺组织热休克蛋白70表达的影响

目的观察香烟烟雾和脂多糖对大鼠肺组织Hsp70表达的影响。方法48只成年雄性Wistar大鼠随机分为6组:健康对照30d组、健康对照3个月组、单纯薰香烟30d组、单纯薰香烟3个月组、单纯气管注入脂多糖组、薰香烟30d加气管注入脂多糖组,每组8只。采用SABC免疫组化法观察Hsp70在各组大鼠肺组织中的表达。结果(1)健康对照30d组、健康对照3个月组、单纯薰香烟30d组、单纯薰香烟3个月组Hsp70阳性产物的平均吸光度值分别为0·194±0·027,0·189±0·025,0·339±0·049,0·147±0·033。单纯薰香烟30d组与健康对照组30d相比大鼠肺组织Hsp70水平显著升高(P<0·05);单纯薰香烟3个月组与健康对照3个月组相比大鼠肺组织Hsp70水平显著降低(P<0·05);单纯薰香烟3个月组与单纯薰香烟30d组相比大鼠肺组织Hsp70水平显著降低(P<0·05)。(2)健康对照30d组、单纯气管注入脂多糖组、薰香烟30d加气管注入脂多糖组Hsp70阳性产物的平均吸光度值分别为0·194±0·027,0·285±0·059,0·143±0·024。单纯气管注入脂多糖组与健康对照30d组相比大鼠肺组织Hsp70水平显著升高(P<0·05);薰香烟30d加气管注入脂多糖组与健康对照30d组相比大鼠肺组织Hsp70水平显著降低,差异具有显著性(P<0·05);薰香烟30d加气管注入脂多糖组与单纯气管注入脂多糖组相比大鼠肺组织Hsp70水平显著降低(P<0·05)。结论香烟烟雾或脂多糖短期暴露使大鼠肺组织Hsp70表达升高;香烟烟雾长期暴露或香烟烟雾与脂多糖短期联合暴露使大鼠肺组织Hsp70表达降低。提示Hsp70可能与慢性阻塞性肺疾病的发病有一定关系。     

热休克蛋白HSP70和gp96在抗病毒感染中的作用

热休克蛋白(HSP)是一组在进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族,是生物在应激条件下产生的一种非特异性防御产物,在调节免疫应答和抗病毒反应中起重要作用。现简要介绍HSP70、gp96(HSP96,GRP94)这两种HSP与病毒感染的关系及在抗病毒感染中的作用。     

热休克蛋白70在心血管疾病中的保护作用

热休克蛋白(heat shock protein70,HSP70)是HSP家族中重要成员,在生物细胞中含量最高,可诱导性最强,具有保护细胞免受刺激损伤,促进受损细胞修复及抗炎、抗凋亡、耐受缺血/缺氧损伤等多种生物学功能。许多研究发现在心肌组织中HSP70表达升高可减轻心肌细胞损伤程度,利于损伤心肌细胞的恢复,在预防和延缓心血管疾病中起到重要作用。因此,热休克蛋白70诱导剂在心血管疾病的防治中具有潜在的临床价值。本文主要对HSP70在心血管疾病中的保护作用进行综述。     

细胞外热休克蛋白70及其生物学功能

热休克蛋白（HSP）一直被描述为一种细胞内蛋白质在胞内发挥一系列生物学作用,参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程。近年来,有研究发现HSP70能被主动释放到胞外,成为细胞外HSP70（extracellular HSP70,eHSP70）,但关于其功能尚不清楚。循环HSP70水平与多种疾病进程密切相关。有研究发现暴露于物理和心理刺激源作用下,HSP70可能通过脂筏或Exosome介导的分泌途径释放到细胞外,作为一种生物活性因子影响多种疾病的进程。     

汉滩病毒感染诱导热休克蛋白70表达

为了解汉滩病毒感染后细胞的应激反应及HSP70的表达与病毒复制的关系,在汉滩病毒A9株感染Vero-E6细胞后,用免疫组织化学及核酸分子原位杂交法,对细胞HSP70基因的表达进行了检测.结果表明,汉滩病毒感染细胞4h后即可诱导Vero-E6细胞表达HSP70,表达可持续至感染后5d,且HSP70在细胞内的分布也有改变.提示汉滩病毒可直接诱导HSP70的高表达.     

热休克反应中小鼠心脏HSP70表达的免疫组织化学研究

用免疫组织化学方法研究了小鼠心脏在不同温度（40、41、44、46℃）热休克处理后,各恢复期（2、4、8、12、24小时）HSP70的表达。结果表明,（1）44、46℃热处理能诱导心肌细胞合成HSP70,以46℃为多（P＜0．01）,且于恢复期4－8小时为合成高峰（P＜0．01）。（2）阳性免疫反应定位于心肌细胞质中,核呈阴性反应。提示了心脏有较强的耐热能力。     

人热休克蛋白70的原核高效表达

将人热休克蛋白基因hsp70片段克隆到高效原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序。将该重组表达载体转化大肠杆菌DH50α,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并以凝胶薄层扫描分析表达水平。结果表明,成功地构建了含人hsp70基因的表达载体pMAL-c2X／hsp70,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为110000并具有抗原活性的融合蛋白;改变诱导温度和时间,目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同。对人hsp70基因的克隆、表达,并对其进行表达条件的优化,为研究HSP70的结构、功能与临床应用提供了必要条件。     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

低氧运动后不同恢复环境腓肠肌热休克蛋白70表达变化

目的：实验旨在观察急性间歇低氧（氧含量12．7％）跑台运动后不同恢复环境下大鼠腓肠肌热休克蛋白HSP70表达的时程变化。方法：雄性sD大鼠进行低氧环境下的急性间歇跑台运动,用Western blot方法检测低氧运动后即刻、低氧运动后低氧恢复及常氧氧恢复1d,2d,7d的大鼠腓肠肌HSP70蛋白表达水平。结果：急性间歇低氧运动后即刻HSP70蛋白表达水平开始升高。常氧恢复第1dHSP70蛋白表达水平显著高于常氧对照组,P〈0．05。第2d、第7d呈现先降低后升高的趋势;低氧恢复中HSP70蛋白表达水平均显著高于常氧对照组,P〈0．05。结论：急性间歇低氧运动后能诱导HSP70蛋白表达水平升高;低氧恢复过程中HSP70蛋白高水平表达维持的时间要比常氧恢复长。     

大鼠液压冲击脑损伤热休克蛋白70基因表达的研究

目的：观察大鼠侧位液压冲击脑损伤时ＨＳＰ７０的表达分布特点及时序性变化。方法：雄性ＳＤ大鼠,给以０．２ＭＰａ液压冲击,造成脑损伤,应用免疫组织化学技术观察冲击后不同时间ＨＳＰ７０在脑组织内的表达特点。结果：冲击侧大脑皮层和脑干ＳＨＰ７０阳性神经辊冲击后２ｈ和４ｈ出现,７并逐渐增强直至１２ｈ;冲击后４ｈ,冲击侧海马ＨＳＰ７０免疫阳性细胞开始出现,４￣１２ｈ,海马ＨＳＰ７０免疫阳性细胞数无明显改变。结     

粉防己碱对豚鼠链霉素性肾损伤的干预作用

研究粉防己碱(Tetrandrine,Tet)对链霉素(Streptomycin,SM)所致的急性肾损伤的干预作用及其保护机制。将双耳ABR阈值≤5dB健康白色红目豚鼠分为(1)正常对照组、(2)Tet组、(3)SM组、(4)SM Tet组,于第11天留取尿标本和肾组织,用浊度法测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性,用光镜、电镜观察肾组织学改变。形态学检测显示SM Tet组肾脏病理变化比SM组小,凋亡细胞也明显少于SM组。SM Tet组NAG活性比SM组低(P<0.01)。上述结果表明粉防己碱对链霉素所致的急性肾毒性效应有明显的拮抗作用,在药物性器官损伤防护中具有潜在的应用前景。     

日本三角涡虫hsp70 cDNA克隆及原核表达

热休克蛋白70 是热休克蛋白家族中的重要成员, 它在保护生物体免受各种胁迫中发挥重要作用。由于其惊人的再生能力, 淡水涡虫作为研究再生和发育的模式动物受到研究者关注。但是, 有关涡虫抗逆性的分子机制却少有报道。研究采用 RACE (Rapid amplification of cDNA end) 技术首次从日本三角涡虫中克隆出hsp70 (Djhsp70)全长cDNA 序列。Djhsp70 cDNA 全长2066 bp, 含有1947 bp 的开放阅读框, 编码648 个氨基酸, 分子量71.18 kD, GenBank 登录号EU380241。DjHSP70 的氨基酸含有真核生物HSP70 家族蛋白的三个标签序列(9–16 位的IDLGTTYS、199—206 位的 DLGGGTFD、334–339 位的IVLVGG)和末端高度保守序列EEVD。经BLAST 检索分析, Djhsp70 的核苷酸序列和推定的氨基酸序列与目前已知HSP70 家族成员高度同源。有趣的是, HSP70 亲缘关系分析表明: 涡虫更靠近脊椎动物, 而与无脊椎动物果蝇和线虫相距较远。为了制备抗体研究DjHSP70 的组织学定位, 实验还成功构建了DjHSP70 表达载体, 在IPTG 诱导下表达出约76 kD 的融合蛋白。Djhsp70 cDNA 的克隆与表达载体的构建为下一步工作奠定了基础。       

HSP70和JNK信号转导通路在肝癌组织中的表达及意义

目的探讨HSP70和JNK信号转导通路在肝癌组织中的作用,以及它们之间的关系。方法用SP免疫组化方法检测62例肝癌组织中HSP70、JNK1、JNK2和c-Jun的表达。应用SSPS统计软件进行数据处理。结果(1)HSP70蛋白1级染色16例(25.8%),2级染色25例(40.3%),3级染色21例(33.9%)。JNK1、JNK2和c-Jun蛋白低表达分别为40例(64.5%)、33例(53.2%)和36例(58.1%),高表达分别为22例(35.5%)、29例(46.8%)和26例(41.9%)。(2)HSP70蛋白表达与肝癌分化程度呈正相关(r=0.449,P=0.000),JNK1、JNK2和c-Jun蛋白表达均与肝癌分化程度呈负相关(r=-0.351,P=0.005;r=-0.303,P=0.017;r=-0.302,P=0.017)。(3)HSP70蛋白的表达与JNK1(r=-0.385,P=0.002)、JNK2(r=-0.309,P=0.015)和c-Jun(r=-0.302,P=0.017)蛋白的表达呈负相关。(4)Kaplan-Meier法生存分析发现HSP70和JNK1蛋白的表达与术后无复发生存时间密切相关(P<0.01)。(5)多因素Cox比例风险模型分析,结果HSP70与预后明显相关(P=0.004)。结论HSP70蛋白与肝癌的进展和预后密切相关。JNK信号转导通路与肝癌的分化有关。HSP70可能通过抑制JNK信号传导途径,而阻断由其介导的肝癌细胞的凋亡,提高了肝癌细胞在应激状态下的稳定性。     

热休克反应中小鼠肾HSP70和乳酸脱氢酶同工酶表达变化的研究

用免疫组织化学和聚丙烯酰胺凝胶同工酶电泳方法研究了小鼠肾在热休克(46℃,30分钟)恢复期(4h和12h)HSP70的表达和乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的变化。结果表明:(1)HSP70主要定位于肾小管上皮细胞胞质中,细胞核内未见表达;(2)HSP70免疫阳性反应在肾髓质较肾皮质强,肾小管较肾小球强;(3)热休克诱导小鼠肾LDH同工酶活性增强。提示:LDH同工酶可能对细胞热耐受性的建立有重要作用。     

大鼠严重烧伤后大脑皮质神经元和腓肠肌细胞bcl-2、HSP70蛋白的表达及意义

目的 探讨大鼠严重烧伤后大脑皮质神经元和腓肠肌细胞bcl-2,HSP70蛋白的表达及其意义。方法 应用免疫组化SP法检测大鼠体表总面积（TBSA）为30%Ⅲ度烧伤后大脑皮质及腓肠肌组织bcl-2,HSP70蛋白的表达及动态变化。结果 严重烧伤后1-3hbcl-2,HSP70在大脑皮质神经元胞浆呈中度阳性表达。此后呈阴性,而在腓肠肌呈强阳性表达且持续至伤后12h。两种蛋白的表达强度及持续时间与细胞的损伤程度密切相关。结论 严重烧伤后bcl-2,HSP70蛋白在抗损伤及决定细胞损伤的差异性方面发挥着重要作用。     

急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺外分泌细胞中hsp70基因的表达

给大鼠胆胰管内逆行注射牛磺胆酸钠制备急性坏死性胰腺炎动物模型,采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及免疫组织化学方法检测了ｈｓｐ７０基因在胰腺外分泌细胞中的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析发现,术后１ｈ即出现ｈｓｐ７０ｍＲＮＡ的高表达,然后开始下降,术后８－１６ｈ恢复至对照组水平。免疫组织化学检测发现,术后１ｈ即可见明显的ＨＳＰ７０蛋白染色,２ｈ最强,然后开始减弱,一直持续至１６ｈ,仍高于对照组水平;阳性染色位于腺泡细胞顶部并呈大颗粒状,而基底部、细胞核及腺泡腔内未见阳性信号。推测急性胰腺炎时胰腺外分泌细胞高表达ｈｓｐ７０基因,可能与其参与大量合成的胰酶的转运及抑制胰酶激活等保护作用有关。     

Extracellular HSP70 levels in diabetic environment in rats

The expression of HSP70 in embryonic cells of mammals and its role for their normal development and protection is an important aspect to be investigated in pregnancy and/or mild diabetes. In this sense, the present study evaluated the effects of mild diabetes on maternal reproductive parameters and HSP70 levels in Wistar rats at different stages of life and in their offspring. Mild diabetes was induced by a beta-cytotoxic drug (streptozotocin) at birth. Four experimental groups were evaluated: at 90 days of age: nonpregnant nondiabetic (ND90) and nonpregnant mild diabetic (D90) female rats, and at term pregnancy: pregnant female rats of both glycemic status were examined (NDP and DP, respectively). The rats were submitted to oral glucose tolerance test, and blood samples were collected for determination of HSP70 levels. In addition, the reproductive performance of pregnant rats was assessed and HSP70 levels determined in their offspring blood samples. The HSP70 levels and maternal reproductive performance presented no difference between ND and D rats, regardless of the life stage. The HSP70 levels were increased in D90 rats and lower in offspring from D rats. Maternal HSP70 levels were positively correlated to the number of dead embryos. In conclusion, mild diabetes did not affect maternal reproductive performance, but high maternal HSP70 levels compromised embryo development. In addition, offspring from D rats exhibited lower HSP70 levels, showing that this protein can be used as an indicator of metabolic consequences of diabetes and predictor of related disorders in adulthood.     

Expression of HSP 70 and its mRNAS during ischemia-reperfusion in the rat bladder

HSP 70 is an important protein that repairs damaged tissue after injury. In the present study, we investigated the expression of HSP 70 and its mRNAs during ischemia-reperfusion in the rat bladder. Rat abdominal aorta was clamped with a small clip to induce ischemia-reperfusion injury in the bladder dome. Male Wistar rats, 8 weeks old, were divided into six groups: controls, 30-min ischemia, 30-min ischemia and 30-, 60-minute, 1- and 7-day reperfusion, groups A, B, C, D, E, and F, respectively. In functional studies, contractile responses to carbachol were measured in these groups. The expression of HSP 70-1/2 mRNAs was quantified using a real-time PCR method, and that of HSP 70 proteins was measured using ELISA in the bladders. In the functional study, Emax values of carbachol to bladders in the A, B, C, D, E and F groups were 9.3 +/- 1.3, 7.9 +/- 1.7, 4.3 +/- 0.8, 4.2 +/- 0.7, 4.5 +/- 0.6, and 8.1 +/- 1.2 g/mm2, respectively. In the control group, the expression of HSP 70-1/2 mRNA was detected, and the expression of HSP 70-1 mRNAs was significantly higher than that of HSP 70-2 mRNAs in each group. The expression of HSP 70-1 mRNA increased in groups B and C, but decreased in groups D, E, and F. The expression of HSP 70-2 mRNA in group C was significantly higher than that of groups A, D, E, and F. The expression of HSP 70-1/2 mRNAs after 1 day or 1 week of reperfusion was similar to control levels. The expression of HSP 70 proteins was increased shortly after the expression of their mRNAs. The expression of HSP 70 after 1 day or 1 week of reperfusion was almost identical to control levels. Our data indicate that contractile responses of the bladder were decreased by ischemia reperfusion, and that expression of HSP 70 and its mRNAs appeared to increase after a short period of the insult.     

胰岛素对大鼠急性肺损伤的肺血管内皮细胞核因子-kB和细胞间粘附分子-1表达的影响

目的 探讨胰岛素对急性肺损伤（ALI）大鼠肺血管内皮细胞核因子-kB（NF-kB）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法24只健康雄性SD大鼠（190-210g）,随机分为正常对照组、ALI模型组、胰岛素干预组。观察肺组织病理形态,采用原位杂交技术半定量法和免疫组织化学染色检测肺血管内皮细胞的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）mRNA和核因子-kB（NF-kB）蛋白的表达。结果（1）肺病理组织学结果显示胰岛素干预组肺病变局限且程度减轻;（2）ALI模型组肺血管内皮细胞ICAM-1mRNA表达（O．456±0．018）和NF-kB核染色阳性细胞百分比（0．542±0．009）与正常对照组（o．274土0．014,0．308±0．017）比较显著升高（均P〈0．05）;（3）胰岛素干预组ICAM-1mRNA表达（0．357±0．024）和NF-kB核染色阳性细胞百分比（0．427±0．018）比模型组明显减低（均P〈0．05）,但与正常对照组比较仍较高（均P＜0．05）。结论ICAM-1和NF-kB在ALI显著增加,胰岛素可以抑制NF-kB和ICAM-1mRNA的表达,可能是其对抗ALI的作用机制之一。