腺苷酸活化蛋白激酶活化对单核细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制北大核心CSCD

本研究旨在探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）活化对单核细胞与内皮细胞黏附的影响及其分子机制。用不同剂量的AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR,0~2 mmol/L）或AMPK抑制剂compound C（10 mmol/L）处理肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα,10 ng/m L）诱导的人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）,用TNFα诱导过表达活性型或显性抑制型AMPK蛋白的HAECs。用荧光染色法观察AMPK对荧光标记的单核THP-1细胞与HAECs黏附的影响。用荧光定量PCR检测血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）和细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）m RNA表达水平,用ELISA法检测二者的蛋白分泌量;用Western blot检测核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）p65的211位点赖氨酸乙酰化水平,用ELISA法检测NF-κB p65DNA结合活性,并用试剂盒检测p300乙酰转移酶活性。通过小干扰RNA抑制HAECs组蛋白乙酰转移酶p300蛋白表达后,检测TNFα对NF-κB p65 DNA结合活性、黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达及单核细胞黏附率的影响。结果显示,AICAR显著抑制TNFα诱导的单核细胞与HAECs的黏附,在HAECs中下调TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1的m RNA水平上调和蛋白分泌。AICAR的效应可以被AMPK抑制剂compound C完全阻断。转染活性型AMPKα显著抑制TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1m RNA表达和分泌,以及单核细胞-内皮细胞黏附,而转染显性抑制型AMPKα则无明显影响。RNAi干预抑制p300活性显著抑制TNFα诱导的黏附分子表达和单核-内皮细胞黏附。AMPK激活可抑制TNFα诱导的p300乙酰转移酶活性,抑制NF-κB p65的211位赖氨酸的乙酰化,降低NF-κB p65 DNA结合活性。以上结果提示,AMPK激活抑制单核细胞-内皮细胞黏附,作用机制可能与其降低p300酶活性,下调NF-κB p65转录活性密切相关。     

旋覆花内酯抑制血管平滑肌细胞炎性应答与阻断NF-κB活化有关

应用免疫细胞化学染色及Western印迹检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)环加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2,COX-2)表达、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)水平和NF-κBp65核转位的变化;电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)确定旋覆花内酯(1-o-acetylbritannilactone,ABL)对核内NF-κBp65与DNA调控元件的结合活性的影响。结果表明,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的VSMC,p65核转位加快,细胞核内的NF-κBp65水平快速升高,同时伴有IκB-α的减少;用ABL预处理VSMC后,LPS诱导的p65核转位增加及IκB-α减少受到明显抑制,抑制作用呈剂量依赖性。EMSA结果显示,LPS处理VSMC,其核蛋白与含有NF-κB结合位点的探针的结合活性升高;而用ABL预处理的VSMC,LPS诱导的核蛋白与探针结合活性的升高受到明显抑制。进而,ABL对NF-κB活化启动的下游炎性基因COX-2表达也具有较强的抑制效果。因此,ABL是一种抗炎物质,通过抑制NF-κB活化和炎性基因COX-2的表达而减弱或消除LPS诱导的VSMC炎症应答反应。     

腺苷酸活化蛋白激酶活化对单核细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制

本研究旨在探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活化对单核细胞与内皮细胞黏附的影响及其分子机制。用不同剂量的AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR,0~2 mmol/L)或AMPK抑制剂compound C(10 mmol/L)处理肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα,10 ng/m L)诱导的人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs),用TNFα诱导过表达活性型或显性抑制型AMPK蛋白的HAECs。用荧光染色法观察AMPK对荧光标记的单核THP-1细胞与HAECs黏附的影响。用荧光定量PCR检测血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)m RNA表达水平,用ELISA法检测二者的蛋白分泌量;用Western blot检测核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)p65的211位点赖氨酸乙酰化水平,用ELISA法检测NF-κB p65DNA结合活性,并用试剂盒检测p300乙酰转移酶活性。通过小干扰RNA抑制HAECs组蛋白乙酰转移酶p300蛋白表达后,检测TNFα对NF-κB p65 DNA结合活性、黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达及单核细胞黏附率的影响。结果显示,AICAR显著抑制TNFα诱导的单核细胞与HAECs的黏附,在HAECs中下调TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1的m RNA水平上调和蛋白分泌。AICAR的效应可以被AMPK抑制剂compound C完全阻断。转染活性型AMPKα显著抑制TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1m RNA表达和分泌,以及单核细胞-内皮细胞黏附,而转染显性抑制型AMPKα则无明显影响。RNAi干预抑制p300活性显著抑制TNFα诱导的黏附分子表达和单核-内皮细胞黏附。AMPK激活可抑制TNFα诱导的p300乙酰转移酶活性,抑制NF-κB p65的211位赖氨酸的乙酰化,降低NF-κB p65 DNA结合活性。以上结果提示,AMPK激活抑制单核细胞-内皮细胞黏附,作用机制可能与其降低p300酶活性,下调NF-κB p65转录活性密切相关。     

MyD88抑制乙型肝炎病毒复制依赖活化NF-κB信号通路

目的 研究髓样细胞分化蛋白(MyD88)抗乙型肝炎病毒(HBV)效应的作用机制。方法 构建MyD88的截短突变体,获得核因子kappa B(NF-κB)超抑制剂IkBa-SR或者NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的表达质粒,分别与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞,检测细胞上清液中HBeAg,HBsAg的表达以及胞质中HBV复制中间体DNA的含量,并以NF-κB依赖的荧光素酶报道系统检测它们活化NF-κB的程度。结果 MyD88全长蛋白和2个截短突变体M(1-151)、M(151-296)活化NF-κB的程度与其抑制HBV蛋白以及复制中间体DNA合成的能力相一致。与空载相比,表达NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的质粒共同瞬转细胞后,转染MyD88和HBV表达质粒的细胞中NF-κB的通路明显活化,同时HBV core蛋白的合成显著降低;而NF-κB的超抑制剂IκBα-SR共同瞬转的细胞中core蛋白的表达量显著增加,检测细胞培养上清液中HBeAg和HBsAg及胞质中HBV复制中间体DNA的合成,得到相似结果。结论 NF-κB信号通路的活化在MyD88抑制HBV复制中发挥了关键作用     

IκB激酶的结构及其三个亚基相关功能

IκB激酶(IKK)在核因子κB(NF-κB)的活化过程中起着重要的催化调节作用.在以往的研究中,主要关注IKKβ催化亚基在NF-κB活化过程中的催化作用,对于IKKα催化亚基和调节亚基IKKγ/NEMO的了解甚少,但近几年的研究发现这三个亚基在NF-κB的活化过程中发挥不同的作用.由于NF-κB与人体免疫、应激以及细胞凋亡等活动密切相关,因此研究启动NF-κB活化过程的关键酶是十分必要的,为临床治疗提供了一定的理论依据.本文简述IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO三个亚基的基本结构特征及其在NF-κB活化过程中的功能和一些其它的特殊调节作用.     

IKKα的研究进展

IκB激酶(IKK复合体)是NF-κB信号转导途径成员之一,包括3个亚基:催化亚基IKKα、IKKβ和调节亚基IKKγ。无刺激时,NF-κB与抑制蛋白IκB家族的一个成员结合,或者与无活性前体(如p100)结合而以无活性形式存在。在外界信号如TNF-α或淋巴毒素β等刺激下,经过复杂的信号转导,IKK复合体被激活,导致IκB和(或)p100发生磷酸化,结果NF-κB被释放出来,进入细胞核内激活靶基因。最新研究发现在TNF-α刺激下,IKKα可直接进入细胞核内,通过催化组蛋白H3磷酸化进而激活特定NF-κB应答基因的表达。IKKα是首次发现的信号转导途径中直接进入细胞核内调节基因表达的上游成分,为NF-κB信号转导途径的研究开辟了新的道路。     

IKKα通过不同机制介导生长促进和生长抑制信号诱导的c-Fos表达和AP-1活化

目的:探讨IKK激酶催化亚基IKKα在分别介导生长促进信号(血清)和生长抑制信号(紫外线UVB)诱导的反应中,调控转录因子AP-1关键组成亚基c-Fos实现诱导表达的信号传递机制。方法:分别采用Western印迹、RT-PCR和萤光素酶报道分析系统检测血清和紫外线刺激反应状态下IKKα对c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化的调控作用;通过转染I-κBα功能抑制型突变体I-κBα-AA,观察NF-κB诱导活化受抑时,c-Fos诱导表达和AP-1诱导活化水平的改变情况。结果:IKKα在生长促进和生长抑制信号诱导的反应中,都能够实现对转录因子AP-1及其关键组成亚基c-Fos诱导表达的调控作用。其中,在血清反应中IKKα可通过NF-κB依赖方式在转录水平调控c-Fos的诱导表达,而在UVB反应中IKKα通过转录非依赖方式调控c-Fos的诱导表达。结论:IKKα能分别以NF-κB依赖和非依赖方式参与调控生长促进和生长抑制信号诱导的反应。     

IFN-g促进LPS对小鼠抑制性巨噬细胞IL-12 p40/p35的表达

IL-12是由p35和p40两个亚基组成的可诱导细胞因子, 其重要的生物学功能是促进Th1细胞分化, 调节细胞免疫的抗病毒和抗肿瘤作用. 用半定量RT-PCR结合银染对LPS, LPS/IFN-γ作用下小鼠抑制性巨噬细胞IL-12 p40 和 p35两个基因mRNA的表达及NF-κB信号与表达的相互关系进行了研究, 发现IFN-γ不仅能显著促进LPS诱导的IL-12 p40 mRNA 的表达, 同样能明显上调IL-12 p35 mRNA水平, 两者表达水平大致相当, 而且IFN-γ 相应地促进了IL-12 p70的分泌. 蛋白酶小体抑制剂PSI显著抑制了LPS, IFN-γ , LPS/IFN-γ 诱导的IL-12 p40, p35mRNA的表达, 并对LPS, LPS/IFN-γ 诱导的Ik Ba 降解也有明显的抑制效应. LPS单独处理可增强NF-κB与小鼠p40基因启动子-146 ～-112区DNA特异序列的结合, 但IFN-gγ并不能加强LPS诱导的NF-k B与DNA的结合, 也不能促进LPS诱导的Ik Ba 降解. 以上结果提示: (ⅰ) IFN-/LPS共同作用, 可促使IL-12 p40和p35 两基因mRNA高水平表达并相互协调. 这种高表达和IL-12 p70的分泌增加相一致. (ⅱ) NF-B是LPS, IFN-g /LPS诱导的IL-12 mRNA表达的基本信号通路. (ⅲ) 蛋白酶小体抑制剂PSI通过抑制Ik Ba 降解, 进而抑制LPS和LPS/IFN-g 诱导的IL-12 p40与p35 mRNA的表达. (ⅳ) IFN-γ 通过非NF-κB信号途径增强LPS诱导的p35/p40 mRNA表达.