重组人pLXSN—CD80逆转录病毒载体的构建及在CHO和PA317细胞中的表达

CD80, a molecule on the antigen presenting cells, provide costimulation signals for T cell activation and play a key role in tumor immune. Based on our previous work of human CD80 full length cDNA cloning, a retrovirus expression vector pLXSN-CD80 was constructed. CD80 expression cells were selected by G418 from pLXSN-CD80 transfected PA317 and CHO cells by calcium phosphate. Expression, distribution and molecular weight (MW) of CD80 were measured by RIA, FACs and western blot. pLXSN-CD80 transfected CHO cells expressed relatively high level of CD80 protein (approximately the same as Raji cells) with an apparent MW of 40 kD. In the presence of G418 or not, pLXSN-CD80 transfected PA317 and CHO cells maintained CD80 expression for five months of passage. The results indicate that our construct is potent for experimental use in gene therapy.     

逆转录病毒介导CD基因在人结肠癌细胞中表达

构建了含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因（ＥＣ－ＣＤ）的重组逆转录病毒载体ＬＣＤＤＳＮ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ。Ｇ４１８筛选得一的稳定表达ＥＣ－ＣＤ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ鹜型ＬｏＶｏ相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ都对５－ＦＵ很敏感（ＩＣ５０约为０．５μｍｏｌ／Ｌ）。表达ＣＤ基因使细胞对基本无毒性的原药５－ＦＣ     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９（１,３－二羟基－珍氧基－甲基）鸟嘌呤选择性地杀死肿瘤细胞,将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒,用该重组病毒转染不鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｙｇｒｏｍ     

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .体外感染实验的成功为进一步进行基因治疗动物实验打下了基础     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响.将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达的变化.重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblotting检测人NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体的构建及其在成纤维细胞中的表达

利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人ＴＮＦ－αｃＤＮＡ和选择基因ＮｅｏＲ基因,使ＴＮＦ－α及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将两基因同时转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成人ＴＮＦ－α双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＮＦ－α．在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为１０６ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株．经ＰＣＲ证明外源基因已整合至细胞基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一ＬＲＴ转录本．持续Ｇ４１８筛选能明显促进目的基因ＴＮＦ－α的表达．用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３,Ｇ４１８筛选获得的混合抗性克隆持续高表达ＴＮＦ－α,４０Ｇｙγ线照射后能维持高效表达至７ｄ．实验结果表明,含ＩＲＥＳ的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体．     

逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 ,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上,缺失病毒基因组的env基因和bel基因,构建了一个表达标记基因neo和报道基因gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI-GFP.在与辅助质粒p△GP共转染情况下,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI-GFP.该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达.     

重组含HSV-TK基因腺病毒的构建及对肿瘤细胞的杀伤作用

构建含CMV启动子和HSV-TK基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMVTK),用PCR及Southern杂交筛选鉴定阳性空斑,证实AdCMVTK含HSV-TK基因。纯化的Ad-CMVTK滴度达10~(12)pfu/ml。GCV对经Ad-CMVTK感染(M.O.I.=100)的HeLa等3种肿瘤细胞的IC50<4μmol/L,同时观察到明显的旁杀伤效应。AdCMVTK/GCV系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

人肝癌细胞株中EGFR的表达和EGF对肝癌细胞生长的促进

本文分析了人肝癌细胞株7404,7721细胞中表皮生长因子受体(EGFR)基因表达和EGF对肝癌细胞生长的促进作用。~(125)Ⅰ-EGF对7404细胞的结合试验表明结合是可饱和的和专一的,从~(125)Ⅰ-EGF对7404、7721细胞结合浓度曲线作Scatchard作图和计算,提示每个7404和7721细胞表面分别有1.1×10~5和0.7×10~5的EGFR分子。Northern杂交分析证明EGFR基因在7404,7721细胞中的转录产物主要是5.6 kb EGFR mRNA,免疫印迹分析证明7404细胞和7721细胞的EGFR为170kd的蛋白。EGF对培养于含10%或0.5%小牛血清的RPMI-1640培液中的7404、7721细胞的贴壁依赖性生长有促进作用,促进作用的程度与培液中CS含量有一定关系,提示EGF的促生长作用可能是EGF与血清中其他成分协同作用的结果。EGF对培养于软琼脂中的7404,7721细胞的贴壁不依赖性生长也有明显促进作用。综合上述实验结果说明EGFR基因在人肝癌细胞中是活跃表达的,EGF可能是肝癌细胞生长依赖的一个重要有丝分裂原。     

逆转录病毒载体介导MGMT和MDR1基因增强人脐血CD34+细胞对联合化疗抗性的研究

为探讨转染六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT)和多药耐药基因(MDR1)的人脐血CD34+细胞能否同时增强对卡氮芥(BCNU)和MDR1基因靶药的抗性,应用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,构建双顺反子逆转录病毒载体G1Na-MGMT-IRES-MDR1,以电穿孔介导的基因转移法导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,采用含BCNU和长春新碱(VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP+E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染,将含MGMT和MDR1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化后的人脐血CD34+细胞,用PCR,RT-PCR,Southern blot,Northern blot,FACS和MTT等方法检测外源MGMT与MDR1基因在CD34+细胞中的转移和表达.结果显示,DNA测序及酶切鉴定证实MGMTcDNA克隆和双顺反子逆转录病毒载体构建的正确性,MACS分离纯化后的人脐血CD34+细胞纯度平均达92%,回收率为75%,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为5.8×105 cfu/ml,逆转录病毒载体介导的双耐药基因已整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达,同时传递不同的耐药表型,应用集落计数、PCR方法测定基因转导效率分别为18%和20%,巢式PCR及补救分析均未检测到辅助病毒存在,经双耐药基因修饰的脐血CD34+细胞对BCNU的IC50较对照组提高4.5倍,对VCR,柔红霉素(DNR)和秋水仙碱(COL)的IC50较未转染细胞分别高7.8,6.6和5.5倍.本研究对降低联合化疗骨髓毒性作用的肿瘤临床研究奠定了实验基础.     

人AADC基因在cos-7细胞中的表达和活性检测

目的　研究人芳香族左旋氨基酸脱羧酶 (AADC)基因在多巴胺代谢过程中的作用。方法　从人胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR法扩增AADCcDNA片段 ,克隆于 pGEM T载体中。测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞COS 7,原位杂交检测AADC表达 ,加入L DOPA后 ,用高效液湘色谱测定转AADC细胞的多巴胺(DA)生成量 ,以了解转基因细胞AADC基因的功能活性。结果　RT PCR扩增出 144 2bp的cDNA片段与Genbank[NM 0 0 0 790 ]登录的序列相同 ,构建真核表达载体 pBK RSV AADC ,原位杂交证实其在COS 7表达阳性率为 70 % - 80 % ,在AADC活性作用下实验组的DA生成量是对照组的 4倍以上 (P <0 0 1)。结论　所克隆的AADC基因可在真核细胞中表达并具有生物活性。可望用于帕金森病的基因治疗。     

中间载体pBz6102的构建及CAT基因在转化烟草中的表达

来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPT),氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)以及来源于昆虫的荧光素酶基因等都是用于研究根癌农杆菌转化植物的良好标记。我们利用氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和来源于Ti质粒T-区DNA的tmr基因,构建了中间载体pBZ 6102,并通过植物基因工程载体pGV 3850,将氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和tmr基因引入了植物细胞,并测到了表达,在抗氯霉素植物中测到了氯霉素乙酰转移酶活性。中间裁体pBZ 6102上还有Pst Ⅰ,Xba Ⅰ等单一的限制性内切酶位点,外源基因极易插入。转化植物F_1代的种子抗性分析表明,80%左右的种子都能在含氯霉素的培养基上正常萌发,它们的幼苗中都有氯霉素乙酰转移酶活性,证明CAT基因通过了减数分裂稳定地保留在植物细胞的基因组内。     

人胰腺内分泌细胞中CD 57免疫反应性的表达

CD57是一种分子量为110 KD的糖蛋白,它是人类自然杀伤细胞(NK)和杀伤细胞(K)的特异性表面抗原。用它免疫小鼠产生的抗CD57单克隆抗体可特异性识别人的NK 和K 细胞表面抗原。本文应用ABC 免疫组织化学染色结合葡萄糖氧化酶DAB-硫酸镍铵显色技术研究了CD 57在人胰腺的表达和分布。结果发现,CD 57免疫反应(CD 57一IR)细胞主要分布在胰腺的内分泌部(胰岛),偶见于胰腺外分泌部的腺泡和导管上皮中。多数CD 57-IR 细胞呈典型内分泌细胞的形态特征。相邻切片法证明大多数Glu,SS,HPP 和PS 免疫反应细胞呈CD 57阳性。胰腺内神经纤维亦呈CD 57阳性。少数呈CD 57阳性的NK 和K 细胞散布在胰腺结缔组织中。本文对CD 57免疫反应性在人胰腺内分泌细胞中表达的意义进行了讨论。     

异源PDGF-A链表达对CHO细胞生长和转化的作用

用DNA磷酸钙盐沉淀方法把含人PDGF(血小板衍生生长因子)A链cDNA的表达质粒pSV_2neo-A转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),然后经G 418(400-800 μg/ml)筛选分离20个转染细胞株。选出其中At_1和Aot7细胞株所进行的实验结果表明,这些细胞的形态和生长行为均发生明显的变化,PDGF-A链mRNA的表达水平比CHO细胞明显增高,胞质有强阳性的PDGF荧光反应,显示有PDGF样蛋白的合成。这些细胞不但生长速率加快,有高密度持续生长的特性,而且能在软琼脂培基上形成大集落和在裸鼠体内接种形成纤维肉瘤,提示外源PDGF-A链基因的表达有使CHO细胞生长失控和发生细胞恶性转化的作用。     

Angiostatin基因真核表达载体的构建及对B16黑色素瘤体内生长抑制作用

Angiostatin是一种新发现的对肿瘤生长有特异抑制作用的抗血管生成因子,实验已证实其对多种肿瘤有明显的抑制作用.本文报告构建了含Angiostatin基因的真核表达载体pAG3,通过建立荷瘤小鼠模型来研究Angio-statin对人黑色素瘤B16的原位生长,植入及与化疗药物DTIC的联合作用等来探讨Angiostatin裸DNA肌肉注射的体内抗瘤效应.实验结果表明Angiostatin可明显抑制C57荷瘤小鼠的肿瘤生长;人黑色素瘤B16细胞植入前5天肌肉注射pAG3能显著阻止正常C57小鼠新肿瘤的形成;但在pAG3与DTIC联合化疗实验中,两者未表现出明显的增强效应.本实验为拓展非病毒介导的Angiostatin抗血管生成基因治疗途径奠定了基础.     

外源血小板衍生生长因子(PDGF)B链基因在CHO细胞的表达

本文总结应用DNA-磷酸钙盐沉淀的基因转移技术,把含人c-sis cDNA的质粒pSM-1,以单独转染或与pSV_2neo共转染方法转入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),经低血清或G_(418)筛选分离得到多个有PDGF表达的细胞株。其中PDGF高表达件——FB_6,细胞形态和生长行为明显改变,可在软琼脂培基上形成集落,细胞生长速率加快,能在低血清(2%)培液中长期传代,细胞的条件培液有刺激静止的NRK细胞(大鼠肾成纤维细胞)DNA合成的活力。RNA点杂交和Southern Blot显示FB_5细胞有??PDGF mRNA的高表达和人c-sis基因的整合,而且,在连续传代7个月后,FB_5细胞基因组中仍然有人c-sis基因存在,说明CHO细胞的不正常生长和转化是由于PDGF基因的稳定整合和高表达所引起。这一稳定转化株(FB_5)是进一步研究PDGF对细胞生长控制和转化功能的理想模型。