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为了研究不同年份生产的乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定性,从分子水平控制乙型脑炎减毒活疫苗质量,确保疫苗安全性,本研究分析了不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列,并与该疫苗原始种子、主种子、工作种子、乙脑病毒强、弱毒株进行比较。结果显示不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列与其原始种子、主种子、工作种子和基因库中登录的乙脑病毒弱毒株SA14-14-2的相应序列完全一致,与乙脑病毒强毒株SA14的E蛋白氨基酸序列比较有9个位点氨基酸发生了改变。不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因稳定性表明该疫苗质量稳定、安全。 相似文献
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乙型脑炎病毒减毒中间株SA14-12-1-7基因组全序列的测定 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14-12-1-7-12 -1-7株进行全序列测定和分析,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制.根据 已发表的SA14-12-1-7株及SA14-12-1-7株的序列,设计6对重叠引物,涵括整个乙脑病 毒的基因组,通过RT-PCR扩增出SA14-12-1-7-12-1-7株的各cDNA片段,分别克隆到pGEM -T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测序.结果表明SA14-12-1-7-12- 1-7株基因组全序列长10976个核苷酸,从96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基 酸.与野毒株SA14-12-1-7和疫苗株SA14-12-1-7的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同 源性均在99%以上,突变位点分散于各个区域,E区有5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关.此 外,NS3、NS5和3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关.综上所述,乙脑病毒减毒中 间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性.全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义. 相似文献
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本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14 12 1 7株进行全序列测定和分析 ,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA14 14 2株及SA14 株的序列 ,设计 6对重叠引物 ,涵括整个乙脑病毒的基因组 ,通过RT PCR扩增出SA14 12 1 7株的各cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA14 12 1 7株基因组全序列长 10 976个核苷酸 ,从 96到 10 394为一个长开放读码框 ,编码 3432个氨基酸。与野毒株SA14 和疫苗株SA14 14 2的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,E区有 5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同 ,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外 ,NS3、NS5和 3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关。综上所述 ,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义 相似文献
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流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2E基因的稳定性 总被引:5,自引:1,他引:5
分别对SA14-14-2(PHK8代)疫苗株及其原野毒株SA14和另2个疫苗传代株[SA14-14-2(PHK17代)和SA14-14-2(鼠脑1代)]的E区基因进行了序列测定.结果表明,乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2在PHK细胞上连传至17代时,发现2个氨基酸突变(E-331、E-398),但不是回复突变.虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内传1代后发生E-107个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段. 相似文献
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乙型脑炎14-2株冻干活疫苗的生产研究 总被引:7,自引:0,他引:7
乙型脑炎病毒14-2株经地鼠肾细胞连续传23代,各代次的病毒滴度和回传乳鼠后的毒力都较稳定,与5-3株无差异。各代次的神经毒力和中枢神经外毒力也与5-3株相同。脑内感染12~14克小白鼠均不致死,皮下感染也不致病。用地鼠肾细胞经36℃培养4天,病毒增殖达到高峰,滴度为8.0~8.5logTCID50/0.2ml。病毒培养液的pH值为7.4~7.6时,病毒增殖高峰可持续3天。以1%明胶、5%蔗糖为保护剂,在冻干后无真空、不充氮的条件下。14—2株活疫苗在37℃可保存10天,室温(16~31℃)可保存4个月,5~8℃可保存一年,病毒滴度均无明显下降.冻干后充氮或不充氮病毒的滴度及稳定性看不出差异。冻干14—2株活疫苗融化后,用Eagle’s液稀释,置22~23℃8小时,滴度不变,若以生理盐水稀释,则可保持2~4小时;以蒸馏水稀释只能稳定2小时。 相似文献
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乙型脑炎减毒活疫苗(SA14—14—2)在豚鼠体内保护作用的免疫… 总被引:1,自引:0,他引:1
本实验将乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株以不同疫苗病毒量(3.87PFU/ml和5.87PFU/ml)分别一次免疫豚鼠,观察其对强毒攻击后抑制毒血症和抗体形成的能力。结果显示疫苗(5.87PFU/ml)免疫组豚鼠攻击前虽然中和抗体阴性或很低,但经攻击感染后不同时间内均未出现病毒血症,对照组豚鼠则于第2,3,4天全部出现病毒血症。表明一次活疫苗免疫后能有效地抑制病毒血症的产生。免疫后30天虽然免疫 相似文献
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在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据. 相似文献
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《微生物学免疫学进展》2016,(6)
目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。 相似文献
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在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据. 相似文献
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为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。 相似文献
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目的构建以乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革4型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒对小鼠的神经毒力。方法通过重叠PCR方法扩增含有登革病毒4型(DENV-4)H241株pr ME基因序列和乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的NS1蛋白前177个核苷酸的融合片段,用Nar I和Bgl II双酶切后替换乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2全长克隆中的相应区域,构建成乙脑/登革4型嵌合全长克隆,通过体外转录和转染BHK21细胞获得嵌合病毒(JEV/DENV-4 chimeric virus,JD4)。通过测定嵌合病毒JD4和2个母本株JEV SA14-14-2株及DENV-4 H241株蚀斑大小、小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力、乳鼠脑内神经毒力,比较JD4和母本株之间的差异。通过将JD4在原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞传代30次,分析传代后嵌合病毒的神经毒力是否减弱及减弱的程度。结果测序结果表明,构建的嵌合病毒JD4基因组序列和预期一致,没有产生新的位点突变。JD4蚀斑较SA14-14-2明显偏小,但和DENV-4 H241株没有明显区别。JD4对3周龄小鼠具有较强的脑内神经毒力,和母本株DENV-4 H241没有差异,对小鼠没有神经侵袭力。乳鼠实验结果表明,嵌合病毒JD4脑内神经毒力虽然略低于母本株DENV-4 H241,但两者之间没有明显差异,都明显强于乙脑疫苗株SA14-14-2。在PHK细胞传代30次后,小鼠神经毒力虽然有所减低,但并不明显。结论成功构建了嵌合病毒JD4,通过测定并比较JD4与母本株的蚀斑特征、小鼠及乳鼠神经毒力等试验,为分析登革疫苗候选株安全性研究奠定了基础。 相似文献
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Japanese encephalitis virus (JEV), a mosquito-borne flavivirus, is a major cause of acute encephalitis, a disease of significance for global public health. In the absence of antiviral therapy to treat JEV infection, vaccination is the most effective method of preventing the disease. In JE-endemic areas, the most widely used vaccine to date is SA(14)-14-2, a live-attenuated virus derived from its virulent parent SA(14). In this study, we describe the biological properties of SA(14)-14-2, both in vitro and in vivo, and report the genetic characteristics of its genomic RNA. In BHK-21 (hamster kidney) cells, SA(14)-14-2 displayed a slight delay in plaque formation and growth kinetics when compared to a virulent JEV strain, CNU/LP2, with no decrease in maximum virus production. The delay in viral growth was also observed in two other cell lines, SH-SY5Y (human neuroblastoma) and C6/36 (mosquito larva), which are potentially relevant to JEV pathogenesis and transmission. In 3-week-old ICR mice, SA(14)-14-2 did not cause any symptoms or death after either intracerebral or peripheral inoculation with a maximum dose of up to 1.5×10(3) plaque-forming units (PFU) per mouse. The SA(14)-14-2 genome consisted of 10977 nucleotides, one nucleotide longer than all the previously reported genomes of SA(14)-14-2, SA(14) and two other SA(14)-derived attenuated viruses. This difference was due to an insertion of one G nucleotide at position 10701 in the 3 noncoding region. Also, we noted a significant number of nucleotide and/or amino acid substitutions throughout the genome of SA(14)-14-2, except for the prM protein-coding region, that differed from SA(14) and/or the other two attenuated viruses. Our results, together with others', provide a foundation not only for the study of JEV virulence but also for the development of new and improved vaccines for JEV. 相似文献
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森林脑炎病毒疫苗株的全基因组序列分析 总被引:2,自引:0,他引:2
实验设计针对森林脑炎病毒的特异性引物,以被森林脑炎疫苗株病毒感染的鼠脑组织中提取的总RNA为模板,用PCR方法分段逆转录合成、扩增序列并测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果表明,该病毒疫苗株的全基因组由10782个核苷酸组成,编码3414个氨基酸。森林脑炎疫苗株病毒全基因序列的测定,为研究该病毒疫苗株的生物学特性提供了分子基础。 相似文献
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将乙型脑炎SA14 14 2减毒株 (简称 14 2株 )病毒液和灭活 14 2株病毒液皮下和腹腔免疫小白鼠 ,P3株死苗作对照 ,测免疫效价 ,结果 14 2株病毒液的效力为 1 8× 10 -5~ 6 .1× 10 -6ID50 /ml,灭活 14 2株病毒液为 9 9× 10 -1~ 7 2× 10 -3 ID50 /ml,P3株死苗为 4 0× 10 -3 ~ 2 2× 10 -4 ID50 /ml。同时免后 14天采血用PRNT法测抗体 ,结果为 14 2株病毒液 1∶2 (皮下和腹腔 ) ;灭活 14 2株病毒液 <1∶2 ,P3株死苗为皮下 1∶2、腹腔 1∶10。结果表明 :14 2株在小白鼠体内的免疫原性远远高于灭活 14 2株病毒液和P3株死疫苗 ,14 2株经灭活后对小白鼠基本无保护作用。 14 2株抗体水平不高 ,而免疫力远高于P3株死苗 ,说明 14 2株与P3株死疫苗免疫性质不同 ,有细胞免疫参与。 相似文献
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Xinyu Liu Xin Zhao Rui Na Lili Li Eberhard Warkentin Jennifer Witt Xu Lu Yongxin Yu Yuquan Wei Guohong Peng Yuhua Li Junzhi Wang 《蛋白质与细胞》2019,10(2):149-153
Dear Editor,Japanese encephalitis(JE)is a mosquito-borne acute neurological infectious disease caused by the Japanese encephalitis virus(JEV).Globally,68,000 cases of the disease are estimated each year,with a fatality rate of as high as 30%and with approximately 30%-50%of survivors suffering from severe neurological sequelae(WHO,2015). 相似文献
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流行性乙型脑炎强毒株和弱毒疫苗株SA14-14-2对猴子和小鼠的致病性和病理学研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了解乙型脑炎 (乙脑 )减毒活疫苗弱毒株SA14 14 2神经毒力的减弱程度 ,本文对弱毒株及其原株SA14强毒株进行了猴体和小白鼠的致病性和病理学变化的比较试验。SA14强毒株病毒 (原始滴度 6 15× 10 8/ml) ,以10 -2 和 10 -4 ~ 10 -7不同稀释度于丘脑两侧合并脊髓注射恒河猴 ,每组除 10 -4 1只外其余均为 2只。另以 10 -4 和10 -6~ 10 -8不同稀释度脑内注射小鼠 ,每组 8只。结果猴子除 10 -4 1只外其余全部发病死亡 ,小鼠则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒 (原始滴度为 8× 10 6/ml)按同样方法注射 4只猴和 30只小鼠 ,结果全部存活。另以SA1410 -2 病毒皮下注射 3只猴未死亡 ,而以 10 -1皮下注射 30只小鼠时则全部死亡。SA14 14 2以 1∶5稀释病毒皮下注射小鼠时则全部存活。病理组织学结果显示二种动物接种SA14株强毒后主要表现为弥散性脑脊髓炎 ,以神经细胞坏死为其主要特征和最突出的病变。猴子的病变以脊髓前角、丘脑和中脑黑质为重 ,小鼠的病变则以大脑皮质、海马部最重 ,脊髓的病变却比脑轻。接种弱毒株的动物则仅有轻微炎症反应、神经细胞坏死极少出现。以上结果表明以脑内接种时恒河猴和小鼠对乙脑病毒均高度敏感 ,以皮下接种时小鼠的敏感性高于猴子。乙脑SA14 14 2弱毒株的神经毒力包括致 相似文献
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目的了解轮状病毒(RV)的LLR疫苗株全基因组基因和蛋白特征、完善关键基因遗传稳定性研究,为疫苗的质量控制和研发提供依据。方法将LLR株毒种第38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR方法扩增LLR株(38代)全基因组11个dsRNA片段和传代病毒VP6基因,分别将其克隆到p GEM-T载体中,进行序列测定与分析。结果 LLR株全基因组11条RNA,由18 498个核苷酸组成,共编码5 796个氨基酸;全基因组研究表明,所克隆的LLR株属于G10P[15]/NSP4[A]/SGⅠ基因型。LLR株VP6基因全长1 356 bp,含编码397个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP6基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与Gen Bank中LLR参考株(L11595)同源性分别为99.9%和99.7%。与16株SGⅠ亚群RV代表株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.0%~99.7%和97.0%~99.2%;与不同亚群RV代表株之间,VP6基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为77.7%~82.2%和92.2%~93.5%;LLR株各代病毒VP6基因核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异。结论 LLR疫苗株关键基因遗传特性稳定,为在分子水平保证LLR株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据;其全基因组克隆,为进一步研究RV生物学、免疫学和确定该病毒的分类学地位提供了科学依据。 相似文献