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1.
产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆 总被引:3,自引:0,他引:3
当酵母细胞处于高渗压环境时,甘油被诱导合成以提高其胞内渗透压,这一过程受HOG途径的调控。GPD1基因为HOG途径的重要靶基因,高效表达使胞内3磷酸甘油脱氢酶酶活水平提高可极大地提高甘油的产量。本研究将产甘油假丝酵母(Candidaglycerologenesis)染色体DNA经Sau3AI部分酶解后的5~10kbDNA片段与经BamHI线性化及CIP处理过的酵母大肠杆菌穿梭质粒YEp51连接,以大肠杆菌DH5α为受体,构建产甘油假丝酵母的染色体基因文库。通过遗传互补法,在含50g/L氯化钠的培养基上筛选出15个转化子,对转化子0601进行了进一步鉴定,转化子0601所含质粒YEp0601带有YEp51的标记并可以消除Saccbaromycescerevisiae642菌株由于其GPD1,GPD2两基因的缺失突变而表现出的渗透压敏感性,表明已克隆到产甘油假丝酵母的编码胞浆3磷酸甘油脱氢酶的基因 相似文献
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t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
应用PCR方法,在tPAcDNA5′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTEY,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选tPAcDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDSPAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定tPA的活性。Muts表型菌表达产物活性最高为2500IU/ml,Westernblot证实表达产物具有天然tPA分子的免疫原性。 相似文献
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酵母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆 总被引:1,自引:0,他引:1
利用以3′-氨基糖苷磷酸转移酶基因(APHI)为报告基因的一套启动子探针质粒pSK-kan401、pSK-kan1105、pSK-kan1238,从酵母Kluyveromycescicerisporus基因组中克隆到8个有较强启动功能的DNA片段,分析出3′端DNA序列,并在酵母Kluyveromyceslactis中通过检测报告基因与3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的mRNA表达量的比值,确定它们的功能强度,其中pSK-kan401-41和pSK-kan1105-51两个克隆的插入片段具有较强的启动子功能,并证明这两个片段在酵母K.cicerisporus中也有启动子功能。 相似文献
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高产稳产聚羟基烷酸的重组大肠杆菌的构建 总被引:7,自引:0,他引:7
重组大肠杆菌Escherichia coliHMS174(pTZ18UPHB) 含有携带聚羟基烷酸(PHA) 合成基因( phaCAB)** 的质粒pTZ18UPHB,是很有潜力的PHA 生产菌,但存在着质粒不稳定和不能合成3羟基丁酸(3HB) 与3羟基戊酸(3HV) 共聚物[P(3HBco3HV)] 的缺陷。将RK2 质粒上的par DE 基因引入pTZ18UPHB 构成质粒pJMC2 ,该质粒可以在宿主E.ColiHMS174 中稳定遗传。将培养基中的磷酸盐浓度降至18 m mol/L,发现E.Coli HMS174(pJMC2) 能够以丙酸为前体合成P(3HBco3HV) ,其中3HV 在共聚物中的含量为5 % ~8 % 。在5L自动发酵罐中分批补料培养E.Coli HMS174(pJMC2) ,培养基初始磷酸盐浓度为15 m mol/L,30 h 后每升培养液中干菌体可达42-5 g,P(3HBco3HV) 占干重的70 % ,其中3HV 在共聚物中的含量为4-9 % 。 相似文献
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将马铃薯Y病毒普通系(PVY0)的外壳蛋白基因克隆到表达质粒pMALc2中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体pMALc2PVY0CP。SDSPAGE及Westernbloting检测结果表明,这一表达栽体在E.coliDH5α中经IPTG诱导可表达分子量为71.8kDa的特异性融合蛋白。以amyloseresin亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为1∶1024的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Westernbloting对PVY进行检测 相似文献
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木糖代谢基因表达水平对酿酒酵母重组菌株产物形成的影响 总被引:12,自引:2,他引:12
以E.coli-S.cerevisiae穿梭质粒YEp24为骨架,将树干毕赤酵母(Pichia stipitis CBS6054)的木糖还原酶(XR)基因XYL1及木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL1分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶I(ADH1)启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子下,构建不同XYL1及XYL2的重组质粒。这些重组质粒分别转化酿酒酵母(H158)受体菌。得到的重组菌株 相似文献
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ANewTechniqueofMicroproteinelectrophoresisandUltrasensitiveStaining1PANGGuangchang2,ZHAODongxu3,YANGXinlinCHENGuangwen... 相似文献
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t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
应用PCR方法,在t-PA cDNA5'端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTE-Y,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选t-PA cDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDS-PAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定t-PA的活性。Mut^s表型菌表 相似文献
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枯草芽孢杆菌B034拮抗蛋白的分离纯化及特性分析 总被引:29,自引:2,他引:29
枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)B034分离自水稻叶面,对水稻白叶枯病菌具有较强的拮抗能力。除去菌体培养液以70%饱和度硫酸铵沉淀所得的拮抗物粗提液对热稳定,对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K、链霉蛋白酶E部分敏感,对氯仿部分敏感,其作用的活性pH范围低至4,高至12以上,比较耐碱性。粗提液经PhenylSepharoseCL4B柱层析、DEAESephacel柱层析和HPLC的Superdex75HR10/30柱层析,得到二个拮抗活性峰:P1和P2。P2经SDSPAGE和PAGEIEF电泳显示为单一蛋白带,分子量503kD,等电点625。自动Edman降解法从P2的N端测出残基序列为IleSerAsnProXIleAspVal 相似文献
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虹鳟生长激素cDNA在酵母中的表达 总被引:10,自引:0,他引:10
采用聚合酶链式反应( P C R) 技术对虹鳟生长激素c D N A 进行改造。将改造后的基因克隆到含酵母 P G K 启动子的大肠杆菌酵母穿梭质粒p M A91 ,转化酿酒酵母 Y33 ,构建表达鱼生长激素的酵母工程菌 Y33(p M Ar G H16) ,并在酵母中获得表达,表达量约占细胞可溶性蛋白总量的3 % 。表达产物作为饲料添加剂投喂罗非鱼,具有明显的促进生长作用 相似文献
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利用以3′-氨基糖苷磷酸转移酶基因(APHI)为报道基因的一套启动子探针质粒pSK-kan401、pSK-kan1105、pSK-kan1238,从酵母Klyveromyces cicerisporus基因组中克隆到8个有较强启动功能的DNA片段,分析出3′端DNA序列,并在酵母Kluyvero8mycese lactis中通过检测报告基因与3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(APDH)的mRNA表达量的比 相似文献
12.
酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能 总被引:2,自引:0,他引:2
通过单倍体分离和紫外诱变,获得了14株树干毕赤酵母(Pichiastipitis)7124和酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)1300的营养缺陷型突变株。用聚乙二醇(PEG)和电诱导融合及致死融合等方法,实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精,其厌氧发酵木糖和木糖葡萄糖混合液的能力明显优于亲株,耐酒精的性能也比亲株树干毕赤酵母7124有所提高。融合子经DNA含量、细胞体积测定和稳定性能实验证明为稳定融合子。 相似文献
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点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因克隆与序列测定 总被引:2,自引:0,他引:2
点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas puncata subsp.punctata)具有脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase PEP)活性。将其染色体DNA有Eco RⅠ部分酶切后回收8-16kb的DNA片段,与EcoRⅠ消化载体pUC18连接后转化E.coil DH5α,用该酶的专一性底物Benzyloxycarbonyl-Gly-β-naphthylamide从质粒库中 相似文献
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棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆?… 总被引:8,自引:0,他引:8
从棒状杆菌(Corynebacteriumsp.SCB3058)初步纯化得到两个2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶,在此基础上利用PCR技术,以基因组DNA为模板,扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到PGEM3Zf(+并转化大肠杆菌DH5α,是到阳性克隆pGEM813。 相似文献
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微胶囊固定化酵母培养的研究 总被引:7,自引:0,他引:7
进行了NaCSPDMDAAC微胶囊固定化酒精酵母和产朊假丝酵母的实验研究。考察了这两种酵母的培养规律,发现微胶囊固定化酒精酵母的产酒精情况与游离培养基本一致,在连续发酵16批后,仍具有良好的性能。同时固定化产谷胱甘肽(GSH)的产朊假丝酵母的研究也表明固定化培养GSH产量与游离细胞产量相近 相似文献
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欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA在乳酸乳球菌中的表达研究 总被引:5,自引:0,他引:5
将欧芹(Petroselinumcrispum)苯丙氨酸脱氨酶(PAL)cDNA亚克隆到组成型表达载体pMG36e启动子P32下游,电穿孔法转化乳酸乳球菌,获得有PAL表达活性的乳酸乳球菌工程菌(pMG36ePAL/L.lactisMG1363)。通过递归PCR合成了一段120bp的调控片段,用以将pMG36e改造为分泌型表达载体pXHS,以翻译偶联的方式表达PAL,可使PAL的N末端带上usp45信号肽,结果亦检测到PAL酶活性。自行分离克隆了乳酸乳球菌热休克蛋白基因dnaJ的启动子区域,构建了热诱导表达载体pXHJ,获得PAL热诱导表达工程菌(pXHJPAL/L.lactisIL1403),经30℃至37℃热诱导,可使PAL表达活性提高至2倍。本文还就乳酸乳球菌PAL工程菌在经典型苯丙酮尿症防治中的应用进行了分析和讨论 相似文献
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参考已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了一对引物,应用RTPCR 技术,扩增了猪瘟兔化弱毒(Hog cholera virus lapinized Chinese strain , HCLV) 和石门强毒株的E0 糖蛋白基因,并将其克隆到pGEMT 载体中,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。结果表明我国这两株强弱不同毒株E0 糖蛋白核苷酸序列同源性和推导的氨基酸序列同源性分别为95-0 % 和94-3 % ,有13 个氨基酸的差异,HCLV 比石门株多了一个潜在的N糖基化位点。将我国这两株病毒与国外已报导的HCV 毒株E0 基因序列进行了比较,发现石门株与日本的两株毒株ALD 和GPE- 同源性较高,核苷酸序列同源性分别为97-4 % 和96-5 % ,氨基酸同源性分别为97-4 % 和96-0 % ,而与欧洲Brescia 株和Alfort 株同源性较低,核苷酸同源性分别为92-2 % 和86-5 % ,氨基酸同源性为95-2 % 和92-5 % , HCLV 与ALD、GPE- 、Brescia、Alfort 株核苷酸同源性分别为95-6 % 、94-9 % 、91-3 % 、85-5 % … 相似文献
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大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究 总被引:4,自引:0,他引:4
735bp的PRLcDNA片段从质粒PRL-SP65#1中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体pcDNA3上,筛选出正向连接重组体pcDNA3-PRLS和反向连接重组体pcDNA3-PRLAS。将重组体pcDNA3-PRLs和空载体pcDNA3分别转入NIH3T3细胞系,用G418筛选出阳性细胞后与未转染的NIH3T3细胞在加E2和不加E2的情况下,用原位杂交的方法,分别用PRLcDNA探针和原癌基因c-H-rascDNA探针进行检测,未转染的NIH3T3细胞在加E2和不加E2时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的NIH3T3细胞也无PRL的表达,而转入重组体pcDNA3-PRLS的NIH3T3细胞则有大量的PRL基因的表达,与对照组相比有显著差异(P<0.01)。正常和转入空载体的NIH3T3细胞有一定程度的原癌基因c-H-ras的表达,当分别加入E2和转入重组体pcDNA3-PRLS后,NIH3T3细胞中的c-H-ras基因表达水平都显著升高(P<0.05)。 相似文献
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耐热芽孢杆菌E2菌株纤维素酶基因克隆的研究 总被引:5,自引:0,他引:5
用质粒pBR322作载体,大肠杆菌E.coli DH5αF’作受体,克隆到耐热孢杆菌E2菌株的羧甲基纤维素酶基因。重组质粒PBG3从产生CMCase的转化子中分离得到。克隆到的CMCase基因位于4.0kbHindⅠⅠⅠ片段上。功能状态CMCase基因被亚克隆到2.4kbDNA片段上。 相似文献