抗精氨酸加压素血清的制备及其初步应用

用戊二醛为偶联剂将精氨酸加压素(AVP)与甲状腺球蛋白连接合成AVP免疫原,免疫家兔获得了高滴度和良好特异性与亲和力的抗精氨酸加压素血清。用此抗血清进行了大鼠和豚鼠下丘脑内AVP样免疫反应物质的定位研究,测定了正常人血浆及大鼠部分脑区AVP免疫活性物质含量,结果与国外报道相近,初步应用结果表明此抗血清适用于放射免疫测定(RIA)和免疫细胞化学(ICC)研究。     

人血浆中血管紧张素Ⅱ放射免疫直接测定法

应用优质抗血清、高比放射度~(125)Ⅰ·ATII及双抗体分离技术,建立了直接测定0.5毫升人血浆中血管紧张素Ⅱ(ATII)的放射免疫分析法。竞争抑制曲线的最小检出量3.6±1.6微微克,精密度4.74±1.4%(28次的m±S.D.)。血浆测定的变异系数为批内7～14%,批间8.7～18%。加入血浆中的ATII可定量回收(97～117%)。随待测血浆加入量增大(0.1至1.5毫升/孵育管),测得ATII量线性增加。8种肽类激素、人血浆及使用的酶抑制剂未显示出明显的干扰。正常人普通饮食时外周静脉血浆ATII浓度:卧位1.5小时以上后26±10微微克/毫升(n=54),与24小时尿钠排出量呈负相关(p<0.01);立位2小时后464±22微微克/毫升(n=17)。低钠饮食或肌肉注射速尿引起血浆中ATII显著激发(p<0.01)。本法可灵敏、精密、特异地正确度量微量ATII,操作简单,每批可测标本数较大。本法的建立有助于各领域中涉及肾素——血管紧张素系统之临床或实验研究工作。     

人血浆中血管紧张素Ⅱ放射免疫直接测定法

应用优质抗血清、高比放射度~(125)I·ATII及双抗体分离技术,建立了直接测定0.5毫升人血浆中血管紧张系Ⅱ(ATII)的放射免疫分析法。竞争抑制曲线的最小检出量3.6±1.6微微克,精密度4.7±1.4%(28次的m±S.D.)。血浆测定的变异系数为批内7～14%,批间8.7～18%。加入血浆中的ATII可定量回收(97～117%)。随待测血浆加入量增大(0.1至1.5毫升/孵育管),测得ATII量线性增加。8种肽类激素、人血浆及使用的酶抑制剂未显示出明显的干扰。正常人普通饮食时外周静脉血浆ATII浓度:卧位1.5小时以上后26±10微微克/毫升(n=54),与24小时尿钠排出量呈负相关(p<0.01);立位2小时后46±22微微克/毫升(n=17)。低钠饮食或肌肉注射速尿引起血浆中ATII显著激发(p<0.01)。本法可灵敏、精密、特异地正确度量微量ATII,操作简单,每批可测标本数较大。本法的建立有助于各领域中涉及肾素——血管紧张素系统之临床或实验研究工作。     

抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析

制备抗麻痹性贝毒GTX2,3单克隆抗体。利用醛化法将GTX2,3与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原。免疫小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。GTX2,3与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联作为检测抗原,用间接ELISA法筛选阳性克隆株。将筛选的阳性细胞株制备腹水。获得三株稳定分泌抗GTX2,3单克隆抗体的杂交瘤细胞株F4、F10、G9。间接ELISA法检测F10细胞株腹水抗体效价为1.4×10^-5。半抗原GTX2,3与载体蛋白偶联后,作为免疫原,可制备高滴度的抗GTX2,3抗血清和单克隆抗体。该抗体对于藻毒素具有高特异性和高亲和力,可用于污染海产品的麻痹性贝毒的检测。     

2种β2-受体激动剂抗血清的比较研究

目的:通过比较分析,为β2-受体激动剂的快速免疫学检测方法及最佳免疫抗血清的选择提供依据。方法:分别以偶氮化法和碳二亚胺法将β2-受体激动剂克伦特罗(CL)和沙丁胺醇(Sal)连接到牛血清白蛋白和卵清蛋白上,免疫家兔;4次免疫后,采血制备抗CL和抗Sal的抗血清;用间接ELISA检测抗血清效价,用间接抑制ELISA检测抗血清交叉反应。结果:为抗CL抗血清的效价为1∶2560,抗Sal抗血清的效价为1∶5120。抗CL抗血清对Sal有0.088%的交叉反应,而抗Sal抗血清对CL有200%的交叉反应;就对CL的抑制而言,抗Sal血清比抗CL血清更敏感。结论:在检测β2-受体激动剂CL时,Sal完全抗原可能是制备抗血清的最佳抗原。     

神经降压素的放射免疫测定

本工作通过戊二醛将神经降压素(NT)连接到甲状腺球蛋白(TG)分子上,免疫家兔,获得了具有较高滴度,良好亲和力和较好特异性的抗神经降压素血清。使用此抗血清建立放射免疫测定,检测大鼠垂体和部分脑区NT免疫活性物质含量,结果与国外文献相近。     

脑啡肽的放射免疫测定

1975年发现亮氨酸脑啡肽(LEK)和甲硫氮酸脑啡肽(MEK)。其测定以放射免疫(RIA)最佳。作者提议并合成了多聚赖氨酸琥珀酰脑啡肽免疫原,EK 结合率81～90%,每2.3或3.2个赖氨酸残基连上一个EK。免疫3或6个月时获得抗EK 血清(ALS 或AMS),工作稀度可达1:5000,K_(eff)10~9升/克分子。试用改进的氯胺T 标记法及DEAE-Sephadex A-25柱层析制备高比放射性~(125)I-EK,免疫活性良好。双抗体法分离抗体结合的和游离的~(125)I-EK。竞争抑制曲线:灵敏度LEK～11微微克,MEK～130微微克;精密度1.8%及1.4%。β-内啡肽,八种肽类激素、吗啡、纳洛酮无明显干扰;交叉反应MEK 对ALS 为3.3%、LEK 对AMS 为<1%。脑组织用0.1N 盐酸抽提,中和后,直接作RIA。本方法已通过多种方法学考验。正常大鼠脑中EK 浓度以下丘脑为最高,尾核次之。本法是灵敏、可靠和特异的。     

脑啡肽的放射免疫测定

1975年发现亮氨酸脑啡肽(LEK)和甲硫氨酸脑啡肽(MEK)。其测定以放射免疫(RIA)最佳。作者提议并合成了多聚赖氨酸琥珀酰脑啡肽免疫原,EK结合率81～90%,每2.3或3.2个赖氨酸残基连上一个EK。免疫3或6个月时获得抗EK血清(ALS或AMS),工作稀度可达1:5000,K_(eff)10~9升/克分子。试用改进的氯胺T标记法及DEAE-Sephadex A-25柱层析制备高比放射性~(125)I-EK免疫活性良好。双抗体法分离抗体结合的和游离的~(125)I-EK。竞争抑制曲线:灵敏度LEK～11微微克,MEK～130微微克;精密度1.8%及1.4%。β-内啡肽,八种肽类激素、吗啡、纳洛酮无明显干扰;交叉反应MEK对ALS为3.3%、LEK对AMS为<1%。脑组织用0.0N盐酸抽提,中和后,直接作RIA。本方法已通过多种方法学考验。正常大鼠脑中EK浓度以下丘脑为最高,尾核次之。本法是灵敏、可靠和特异的。     

除草剂2,4-D特异性多克隆抗体的制备及鉴定

目的是制备特异性的2,4-D多克隆抗体.用活性酯和混合酸酐法将半抗原2,4-D分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联;以2,4-D-BSA作免疫原免疫两只新西兰白兔;以2,4-D-OVA包被96孔酶标板,用间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗血清效价和竞争性ELISA法检测2,4-D.结果显示2,4-D与BSA和OVA的偶联比率分别为32∶1和18∶1,抗血清效价＞6.4×105,在优化条件下2,4-D的最低检测限达37ng/mL.实验成功地制备了2,4-D特异性多克隆抗体,为其ELISA方法的建立提供了条件.     

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体;为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。构建CD47胞外区原核表达载体,诱导表达及纯化CD47蛋白,免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示,成功构建CD47胞外区原核表达载体,获得纯度大于90%的CD47蛋白,表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合;ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后,抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000,免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。     

小鼠DEAF1多克隆抗体的制备及应用

为研究DEAF1在小鼠胰淋巴结中的内源性表达及调控外周组织抗原基因表达的机制,将DEAF1的原核表达质粒转化至E.coli BL21中,诱导获得重组DEAF1蛋白;经尿素梯度裂解包涵体纯化获得的重组DEAF1蛋白分期免疫Balb/C小鼠,获取鼠抗DEAF1的多克隆抗血清;采用ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫沉淀分别鉴定其效价、特异性、敏感性和亲和力。结果表明,抗血清可与抗原发生特异性的免疫反应,可用于检测DEAF1的表达及荧光定位,抗血清与抗原有较高的亲和力。结果证明所制备的多克隆抗血清具有较高的特异性、敏感性和亲和力。     

高效价兔抗小鼠IgG抗血清制备

在免疫学技术中,如放射免疫,免疫酶标技术,免疫荧光等方法常用标记的第二抗体来检测小鼠抗原特异性抗体,包括单克隆抗体的产生。如何获得高效价的兔抗小鼠抗血清,是一个重要的技术问题。经常遇到的一个问题就是所获抗血清的效价常不够理想。我们在     

用灵敏的血管紧张素Ⅰ放射免疫分析法测定血浆肾素酶活性

报导一个简单的血浆肾素活性(PRA)测定法,利用灵敏的放射免疫分析法(RIA)测定血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)产生速率。抗ATI血清是用多聚左旋赖氨酸-琥珀酰-ATⅠ免疫家兔而获得,它和七种肽类激素的免疫学交叉反应是可以忽略的,其中与ATⅡ为低于0.2%。它的有效亲和常数K_(eff)高至4.4×10~(10)升/克分子。使用这个优质抗血清及~(125)Ⅰ标记ATⅠ,并结合双抗体分离技术,已建立了一个特异而灵敏的RIA。其检出极限是9.1±2.7微微克ATⅠ/管(均值±标准差),精密度是1.5±0.8%;测定保温后血浆中ATⅠ(136微微克量及3批连续测定中)批内变异系数C.V是2.5%,批间C.V.是15%。当确定PRA方法学时,研究了一些影响因素,并证实了血浆保温条件显著地影响ATⅠ的产生速率。我们的方法具有某些优点,例如:1)一旦血液被采集,立即加入作为抗凝剂和ATⅠ保护剂的Na_2·EDTA,8-羟基喹啉和二巯基丙醇;2)保温的血浆中加入1/10体积4MTris-HCl缓冲液(pH 7.4),使它维持在生理条件而又尽可能减少稀释;3)证明当保温期间ATⅠ的生成量线性范围可维持3～6小时以上;4)加至血浆中未标记ATⅠ的回收率达98.5%,表明在37℃3小时(PRA)及4℃3天(RIA)的整个保温期间,满意地抑制了蛋白水解酶的作用。为了测试PRA法的精密度,对二份混合血浆,在连续5批检定中进行复管测定,得均值是0.88毫微克AT Ⅰ/毫升/小时和2.35毫微克AT Ⅰ/毫升/小时,其批内C.V.分别是4.3%和1.7%,批间C.V.分别是20%和10%。     

抗血管紧张素原多克隆抗血清的制备及鉴定

为深入研究血管紧张素原（angiotensinogen,AGT)的表达和组织分布特征,我们以原核表达的AGT蛋白C末端片段为免疫原免疫家兔,制备了针对AGT的多克隆抗血清,并对其进行了ELISA、Western印迹分析及免疫组化鉴定。结果发现,经多次免疫后获得的多克隆抗血清不仅效价高（1：25600）,而且能特异性地针对组织内源性及原核表达的AGT蛋白,同时在人和大鼠组织AGT之间会发生交叉反应。以此抗血清进行免疫组化染色,观察到人胰腺的胰岛细胞及杆内胆管上皮细胞胞浆均有AGT蛋白表达。以上结果提示,利用大鼠杆菌融合表达的AGT蛋白可有效刺激家兔产生AGT抗体。本工作为进一步研究AGT乃至局部RAS的生理、病理意义提供了重要的实验工具。     

双链核糖核酸免疫化学研究I．双链多聚[I]：多聚[c]的抗原性

用国产多聚肌苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸(简称多聚[I]：多聚[c])制备成双链核糖核酸特异性抗血清,用环状沉淀和’H标记的番茄花叶病毒双链核糖核酸测得抗血清效价分别为1：128和1：6400。用免疫琼脂双扩散、对流免疫电泳和放射免疫测定可测定出多聚[I]：多聚[c]的最低浓度分别为391ng、12．2／ng和10pg／ml抗血清和酵母、TMV、P。X的单链核糖核酸、小牛胸腺DNA不反应。试验证明用国产多聚[I]：多聚[C]制备的抗血清,可有效地用于双链核糖核酸的免疫化学鉴定。由于在免疫双扩散和对流免疫电泳中抗血清能和微量双链核糖核酸反应并产生可见沉淀线,从而有可能利用这两种简便灵敏的方法测定病毒的双链RNA,单链RNA病毒的RF型RNA,以及双链RNA真菌病毒的筛选。     

双链核糖核酸免疫化学研究 Ⅰ.双链多聚[I]:多聚[C]的抗原性

用国产多聚肌苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸(简称多聚[I]:多聚[C])制备成双链核糖核酸特异性抗血清,用环状沉淀和~3H标记的番茄花叶病毒双链核糖核酸测得抗血清效价分别为1:128和1:6400。用免疫琼脂双扩散、对流免疫电泳和放射免疫测定可测定出多聚[I]:多聚[C]的最低浓度分别为391ng、12.2/ng和10pg/ml抗血清和酵母、TMV、PVX 的单链核糖核酸、小牛胸腺DNA不反应。试验证明用国产多聚[I]:多聚[C]制备的抗血清,可有效地用干双链核糖核酸的免疫化学鉴定。由于在免疫双扩散和对流免疫电泳中抗血清能和微量双链核糖核酸反应并产生可见沉淀线,从而有可能利用这两种简便灵敏的方法测定病毒的双链RNA,单链RNA病毒的RF型RNA,以及双链RNA真菌病毒的筛选。     

人骨形成蛋白1-cDNA基因工程表达产物抗体的制备及鉴定

应用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白(human bone morphogenetie protein,HBMP-1)的N端片段作为免疫原,免疫新西兰大白兔,成功地制备了抗人骨形成蛋白的抗血清,经免疫转移电泳证实该抗血清有较好的特异性,用ABC免疫组织化学方法在正常和恶性肿瘤骨的石腊切片上检测抗血清效价为1:100～1:1000,免疫组化染色结果表明,HBMP存在于人胎下颌骨新生的骨质和骨细胞中,颌骨骨肉瘤和软骨肉瘤的瘤细胞呈BMP强阳性反应,这一结果表明,骨的生长、形成和骨肿瘤的发生与BMP密切相关。     

邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定

采用碳化二亚胺法,将邻氯青霉素（cloxacillin）与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术获得了一株能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H8-B1-F4。间接ELISA方法测定,抗体亚类为IgG1,其细胞上清抗体效价为1：1000,腹水效价为1：4×105。与其结构类似物苯唑青霉素、双氯青霉素的交叉反应率为21.3％和19.6％,和氨苄青霉素、羟氨苄青霉素和苄青霉素无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测邻氯青霉素的 ELISA试剂盒奠定基础。     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定

【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得了抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该融合基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107L/mol。【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

血清白蛋白在多聚阳离子－壳聚糖共混材料表面的构象变化及其与细胞生长的关系

用L-多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及L-多聚鸟氨酸三种多聚阳离子对壳聚糖进行共混修饰,制备了三种共混材料.在这些材料表面吸附了血清白蛋白,并利用圆二色(CD)光谱研究了白蛋白吸附到材料表面后的构象变化.结果显示,与天然状态相比,白蛋白吸附到共混材料表面后,其α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲的含量均发生了明显改变.通过研究MC3T3-E1细胞在这些材料表面的生长情况,发现细胞的增殖与血清白蛋白的构象变化有一定关系,在吸附的白蛋白构象与天然构象最接近的共混材料表面,MC3T3-E1细胞增殖水平最高.