棉蚜2个乙酰胆碱酯酶cDNA片段的基因克隆与序列分析

采用RT－PCR技术,利用简并引物从棉蚜（Aphis gossypii Glover)中克隆出2个乙酰胆碱酯酶基因的cDNA片段,Ag,ace 1l和Ag.ace2.Ag.ace1基因的cDNA片段为282bp,编码94个氨基酸;Ag.ace2基因的cDNA片段为264bp,编码88个氨基酸。扩增获得的2个乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段所编码的氨基酸序列均与其他昆虫的乙酰胆碱酯酶基因有很高的同源性。首次从一种昆虫中克隆出2个乙酰胆碱酯酶基因片段,为同一种昆虫中存在多个乙酰胆碱酯酶基因的假设提供了直接的分子生物学证据。     

小菜蛾碱性磷酸酶基因cDNA片段的克隆及其序列分析

利用DNAman设计简并引物,通过反转录一多聚酶链式反应(RT-PCR)克隆小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗性、敏感种群中可能与苏云金芽孢杆菌(Bt)抗性相关的碱性磷酸酶基因。琼脂糖电泳结果显示扩增条带与预期片段长度一致,阳性克隆经测序获得了403bp的基因片断。经blast比较得出所克隆基因属于碱性磷酸酶基因。与敏感种群相比,抗性种群中该基因片段有18个碱基发生变化,有1个氨基酸发生替换(缬氨酸转变为苏氨酸)。研究结果对于进一步研究小菜蛾全基因结构、功能有重要的意义。     

棉铃虫细胞色素P450 cDNA片段的克隆与序列分析

以 5龄实验室敏感品系棉铃虫Helicoverpaarmigera的总RNA为模板 ,采用简并性引物 ,利用反转录 -多聚酶链式反应 (RT PCR)扩增出了 2个新的长度分别为 2 3 7bp和 2 40bp的cDNA片段。序列分析表明 ,2 3 7bp的cDNA片段与棉铃虫P45 0CYP4家族有较高的相似性 ,最高达 73 %;而 2 40bp的cDNA片段与CYP6家族有较高的相似性 ,最高达 49%。     

抗性小菜蛾的乙酰胆碱酯酶敏感性

用FAO推荐的点滴法测定了小菜蛾Plutella xylostella(Linn.)对马拉硫磷和西维因的抗药性,并对抗性?和敏感(S)小菜蛾幼虫的胆碱酯酶(ChE)的性质、活性、动力学和抑制作用进行了研究.广州天河、上海梅陇的小菜蛾对马拉硫磷的抗性分别是江西南昌种群的113.8和27.4倍;它们对西维因的抗性是》3.1倍.R幼虫ChE对乙酰胆碱(ATCh)、丙酰胆碱(PrTCh)和丁酰胆碱(BuTCh)的活性分别是S幼虫的0.3、0.7和9.9倍;它们的V_max分别是0.4、1.4和7.0倍;K_m分别是209.1,87和37.8倍.毒扁豆碱、西维因、对氧磷、敌敌畏和残杀威对R幼虫AChE的抑制中浓度I₅₀,分别是S幼虫的333.3,66.7,17.2,12.5和10.0倍.对氧磷、敌敌畏、残杀威和西维因对R幼虫的双分子速率常数K₁,分别是S幼虫的126.4,86.5,32.9和12.3倍.由此可见,AChE敏感度降低是小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯产生抗性的主要机理之一.本文中还讨论了防治抗性小菜蛾的策略.     

小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析

利用CODEHOP设计简并引物,通过反转录多聚酶链式反应(RTPCR)克隆小菜蛾Plutellaxylostella抗性种群中抗性相关的羧酸酯酶基因,随机挑取测序5个阳性克隆进行测序,测序结果经过blastx比较,发现所获得的大约420bp的基因片断均为羧酸酯酶基因,与双翅目昆虫蚊子的氨基酸序列同源性达85%以上 。     

小菜蛾抗性个体不敏感乙酰胆碱酯酶的鉴定

乙酰胆碱酯酶(AChE)敏感性降低是小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯产生抗性的重要机制之一,已得到广泛的承认和报道。一种用硝酸纤维素膜的斑点法鉴定个体小菜蛾的抗性AChE不敏感性的应用技术,提供了早期侦测和随后监测田间种群抗性的可能性。此法操作简便灵敏。小菜蛾抗性品系(GBR)和田间种群成虫头部AChE活力,在残杀威抑制时,抑制率分别为50.97%和43.96%,有对氧磷存在时,分别为63.78%和35.87%,较敏感品系的AChE为不敏感。     

褐飞虱乙酰胆碱酯酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT_PCR)结合快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens 乙酰胆碱酯酶基因cDNA。该cDNA全长2 467 bp,包含一个1 938 bp的开放阅读框(GenBank登录号AJ852420); 在推导出的646个氨基酸残基的前体蛋白中, N端的前30个氨基酸残基为信号肽,随后的616个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为69 418 D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基(Ser242,Glu371和His485),以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守; 位于催化功能域的14个芳香族氨基酸中有10 个完全保守。该酶的氨基酸序列与黑尾叶蝉的同源性最高,达83%。对来自23种昆虫（包括褐飞虱）的30个乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,褐飞虱的乙酰胆碱酯酶与其中6个Ⅱ型乙酰胆碱酯酶（AChE2）同属一个支系; 此外,只存在于昆虫AChE2中的超变区及特异的氨基酸残基,也存在于褐飞虱的乙酰胆碱酯酶中。以上结果表明,所克隆的褐飞虱的乙酰胆碱酯酶基因是一个与黑腹果蝇的orthologous型基因同源的AChE2基因。     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因Dd-ace-2全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE技术克隆了甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)乙酰胆碱酯酶基因(Dd-ace-2) cDNA (GenBank 登录号EF583058), 用DNAMAN5.0、MEGA3.0进行了序列分析。克隆的Dd-ace-2 基因cDNA全长2425 bp, 包含一个2205 bp的开放阅读框, 编码734个氨基酸。Dd-ace-2基因推导的氨基酸序列与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)和动物寄生线虫胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)ace-2的氨基酸序列同源性分别达48.0%、42.7%和42.1%。在推导的734个氨基酸残基的前体蛋白中, 前面的701个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列, 其预测的分子量为79240.38 D。在一级结构中, 形成催化活性中心的3个氨基酸残基(Ser291, Glu442和His574)、胆碱结合位点Trp(177), 以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守; 在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基, 其中10个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示, 甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与其它线虫乙酰胆碱酯酶ACE-2同属一个支系。     

小菜蛾酯酶基因的克隆

根据已知的酯酶基因的保守性氨基酸序列设计简并引物 ,通过逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出小菜蛾PlutellaxylostellaL .酯酶基因片段 ,然后按照测序结果再设计 1对特异引物 ,利用PCR方法 ,筛选小菜蛾的cDNA文库。将RT PCR获得的 1条长度为 3 3 0bp的目的条带 ,亚克隆入T -载体 ,测序结果表明共得到了 1 0个不同的酯酶基因片段。利用特异引物对小菜蛾的cDNA文库进行初筛 ,显示文库中存在有小菜蛾的酯酶基因。     

小菜蛾及菜蛾绒茧蜂乙酰胆碱酯酶敏感性的相关变化

用生物测定和生化检测的方法,对福州地区小菜蛾Plutella xylostella和菜蛾绒茧蜂Apanteles plutellae的抗药性及两种昆虫乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的敏感性进行了田间监测。结果显示,从1998年9月至1999年4月,小菜蛾乙酰胆碱酯酶对6种有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂敏感性逐渐恢复,寄生于同一虫源的菜蛾绒茧蜂乙酰胆碱酯酶敏感性的变化也呈明显的相关性,但菜蛾绒茧蜂乙酰胆碱酯酶的敏感性高于其寄主小菜蛾。脱离选择压力后,两种昆虫对杀虫剂的敏感性迅速恢复,乙酰胆碱酯酶的K_i值显著增高。对乙酰胆碱酯酶的K_m、V_max和K_i值测定结果表明,两种昆虫对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的抗性与乙酰胆碱酯酶对杀虫剂的不敏感性有关。此外还研究了不同发育期小菜蛾乙酰胆碱酯酶活性及其K_i值的变化。探讨了在杀虫剂选择压力下,两种昆虫乙酰胆碱酯酶敏感性的环境适应性变化机制。     

不同地理种群小菜蛾对甲胺磷的抗药性

采用浸叶法研究了福州建新镇、福建农林大学校园内、闽侯县上街镇和闽侯县甘蔗镇等地田间小菜蛾种群对甲胺磷的抗性水平及抗性机制。结果表明,与敏感小菜蛾相比,上述4个田间小菜蛾种群已对甲胺磷产生了34-82倍的抗性水平。敏感小菜蛾乙酰胆碱酯酶(AChE)的Ki值是田间抗性小菜蛾AChE的Ki值的17.3-39.1倍。不同小菜蛾种群对甲胺磷的抗性水平也存在着差异,小菜蛾种群AChE对甲胺磷的敏感性大小与其对甲胺磷的抗性水平高低显著相关。     

阿维菌素对小菜蛾的抗性选育及其对解毒酶活性的影响

用阿维菌素对小菜蛾Plutella xylostella (L.)进行了抗性选育,并对选育过程中小菜蛾解毒酶的活性进行了研究。选育从F₀至F₂₁代,抗性缓慢波动上升,达到选育前的122.91倍;F₂₁至F₂₇代,抗性迅速增长,达到选育前的812.73倍,抗性发展趋势呈现S型曲线。随着选育代数的增加,对乙酰胆碱酯酶(AChE)没有明显的影响;羧酸酯酶(CarE)活性,F₂₇是F₀的1.5倍,从F₂₂开始,活性在较高水平上波动;谷胱甘肽转移酶(GST)活性F₂₇是F₀的2.2倍,且从F₁₈开始,活性在较高水平上波动。选育的抗性品系,增效醚对阿维菌素增效6.34倍。     

鹅副粘病毒SF02 F基因的序列分析及SF02的多重RT—PCR鉴别

对新近分离的鹅副粘病毒SF0 2采用RT PCR方法 ,扩增F基因后测序 ,得到全长的F基因。该基因的ORF总长为 16 6 2nt,编码 5 5 3个氨基酸 ,其裂解位点的序列为112 R R Q K R F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符。其核苷酸和氨基酸同源性分析 ,并与国内新城疫病毒标准强毒株F4 8E9相比较 ,表明该毒株在F基因上已发生了较大的变异 ,而与近年来在我国台湾和部分西欧国家流行的禽副粘病毒有很高的亲缘关系。在分析F基因序列的基础上 ,设计 3条引物 ,建立了一种新的多重RT PCR方法 ,能区分鸡新城疫病毒与鹅副粘病毒。     

苏云金杆菌预处理小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的增效作用

研究了小菜蛾Plutella xylostella幼虫经苏云金杆菌Bacillus thuringiensis预处理后,对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂敏感性的变化以及预处理对小菜蛾幼虫体内乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽的含量的影响。结果表明：苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾幼虫后,其对甲胺磷、水胺硫磷和克百威的敏感性分别为未处理组的6.74、8.83和8.50倍;处理敏感小菜蛾幼虫后则分别为未处理组的2.96、1.69和3.88倍。苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾,未处理组乙酰胆碱酯酶的K_m和V_max值分别为预处理组的1.86和1.56倍,所使用的6种杀虫剂对乙酰胆碱酯酶的K_I值,处理组为未处理组的1.80～2.66倍,苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾对羧酸酯酶的K_m、K_I影响不大,但能显著地抑制羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性并导致谷胱甘肽含量下降(对照分别为处理的2.02、1.76和1.66倍)。苏云金杆菌预处理敏感小菜蛾,对乙酰胆碱酯酶的K_m、V_max、K_I值和羧酸酯酶的K_m、K_I值以及谷胱甘肽含量影响不大,但能显著地抑制羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性(对照分别为处理的1.54和1.64倍)。     

cDNA sequence analysis of ribosomal protein S13 gene in Plutella xylostella （Lepidoptera： Plutellidae）

Ribosomal protein S 13 gene has been cloned and analyzed in many organisms,but there are few documents relating to insects. In this communication, the full-length cDNA sequence of ribosomal protein S 13 gene in the diamondback moth, Plutella xylostella(Lepidoptera: Plutellidae), was determined by using PCR amplification technique. The features of the ribosomal protein S 13 gene sequence were analyzed and the deduced amino acids sequence was compared with those from other insects. The results of multi-alignment of the amino acid sequences between the diamondback moth and other insect species revealed that this gene sequence is highly conserved in insects. Based on maximum likelihood method, a phylogenetic tree was constructed from 10 different species using PHYLIP software. It showed that nematode is one separate lineage and the five insect speciesbe long to another lineage, whereas those species higher than insects form the third one. The pattern of this phylogenetic tree evidently represented the evolution of different species.     

丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从北京株丙型肝炎病毒中扩增出ＮＳ３区基因片段,该片段经ｐＧＥＸ－Ｔ载体克隆到大肠杆菌ＤＨ５α菌株中．经自动序列分析仪测出ＮＳ３基因的７２８ｂｐ长的核酸序列．发现在该片段中第３１位核苷酸发生Ａ→Ｔ突变,产生一个终止突变．这表明,丙型肝炎病毒北京株存在一定的变异,产生缺陷型病毒,这类缺陷型病毒的出现可能是丙型肝炎病毒持续性感染的原因之一．