靶向小鼠Idua基因的CRISPR/Cas9系统构建及打靶效率分析

黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS)是一种遗传代谢病.人IDUA基因编码的α-L-艾杜糖苷酶(α-L-iduronidase,IDUA)功能异常是导致Ⅰ型MPS的主要病因.本研究拟构建特异性靶向小鼠Idua基因的CRISPR/Cas9编辑系统,用以模拟人IDUA基因突变,为建立精准模拟Ⅰ型MPS的细胞模型和动物模型提供高效基因编辑系统.本研究筛查了人类IDUA基因的致病突变,并将候选突变位点定位于小鼠Idua基因上,作为拟突变位点.然后通过sgRNA的设计、表达质粒构建、转染、药物筛选、TA克隆测序等步骤证明了设计的sgRNA具有高效的打靶效力.本研究结果对深入研究MPS的致病机制和探讨MPS的治疗具有重要意义.     

肝素C5异构酶的表达优化及分子改造

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17) 是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体 (N-sulfoheparosan) 的D-葡萄糖醛酸 (D-GlcA) 上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸 (L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+) 和pCold Ⅲ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pCold Ⅲ表达酶活最高,达到(1 873.61±5.42) U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到 (2 409.25±6.43) U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体 (V153R) 的酶活和比酶活分别为 (5 804.32±5.63) U/L和(145.14±2.33) U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。     

粘多糖贮积症Ⅱ型患者IDS基因的2个新突变

为了研究粘多糖贮积症II型(MPS Ⅱ)患者发病的分子遗传学机制, 采用PCR扩增艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)基因突变热点区(外显子2、3、5、7、8和9)、DNA测序分析和限制性内切酶图谱分析的方法, 对2个粘多糖贮积症Ⅱ型家系进行了遗传突变分析。结果表明, 2个家系患者的IDS 基因分别出现IVS 6-1g→a和c.1587~1588 ins T 2个新突变。前者属于单碱基替换, 位于内含子6的3′端剪接位点, 导致跨外显子剪接; 后者属于插入突变, 插入点位于外显子9的cDNA 1,587和1,588碱基之间, 是迄今为止报道的人类IDS基因插入突变中最接近肽链末端的突变, 导致移码突变和转录提前终止。经限制性酶切分析, 证实2个家系中的患者母亲是突变基因的携带者, 符合该病X染色体隐性遗传的规律。另外,在对随机抽取的50名正常人及另外6名不相关的粘多糖病人的测序分析中, 未检测到这2个突变, 说明不是多态性。对于筛查所得的2个新突变是否是患者的致病原因, 尚需进一步证实。     

用荧光底物测定半乳糖6-硫酸酯酶的简易方法

半乳糖6-硫酸酯酶(Gal-6~S)是粘多糖贮积症ⅣA型(MPs IVA)的缺陷酶。以往,MPS IVA的酶学诊断均采用同位素标记的放射性寡糖充当底物,这种底物很不稳定,在贮存过程中需要反复的纯化才能使用,很难实行商品化;而且,成本较高,操作程序复杂费时,严重地限制了MPS IVA诊断工作的开展。基于上述种种不利因素,我们利用市销的4-甲基伞型酮半乳糖苷(4 Mu-Gal),通过硫酸化的原理合成了一种新的荧光底物:4-甲基伞型酮6-硫酸半乳糖苷     

石莼多糖裂解酶的研究进展

石莼多糖(Ulvan)由3-硫酸化鼠李糖,葡糖醛酸,艾杜糖醛酸及一些随机分布的木糖组成。石莼多糖及其降解得到的寡糖在医疗、食品等领域具有广泛的应用前景。为促进对石莼多糖裂解酶这一石莼多糖利用工具的开发,对石莼多糖裂解酶的底物组成,来源分类,序列及进化关系,酶学性质及作用模式,蛋白结构以及作用机制进行了综述,以求对后续石莼多糖裂解酶研究者提供帮助。     

Genetic Analysis of 17 Children with Hunter Syndrome:Identification and Functional Characterization of Four Novel Mutations in the Iduronate-2-Sulfatase Gene

Mucopolysaccharidosis type II （MPS II） is a rare X-linked disorder caused by alterations in the iduronate-2-sulfatase （IDS） gene. In this study, IDS activity in peripheral mononuclear blood monocytes （PMBCs） was measured with a fluorimetric enzyme assay. Urinary glycosaminoglycans （GAGs） were quantified using a colorimetric assay. All IDS exons and intronic flanks were bidirectionally sequenced. A total of 15 mutations （all exonic region） were found in 17 MPS II patients. In this cohort of MPS II patients, all alterations in the IDS gene were caused by point nucleotide substitutions or small deletions. Mutations p.Arg88His and p.Arg172＊ occurred twice. All mu- tations were inherited except for p.Gly489Alafs＊7, a germline mutation. We found four new mutations （p.Ser142Phe, p.Arg233Gly, p.Glu430＊, and p.Ile360Tyrfs＊31）. In Epstein-Barr virus （EBV）-immortalized PMBCs derived from the MPS II patients, no IDS protein was detected in case of the p.Ser142Phe and p.Ile360Tyrfs＊31 mutants. For p.Arg233Gly and p.Glu430＊, we observed a residual expression of IDS. The p.Arg233Gly and p.Glu430＊ mutants had a residuary enzymatic activity that was lowered by 14.3 and 76-fold, respectively, compared with healthy controls. This observation may help explain the mild disease phenotype in MPS II patients who had these two mutations whereas the p.Ser142Phe and p.Ile360Tyrfs＊31 mutations caused the severe disease manifestation.     

中国人Ⅱ型MPS家系IDS基因的一种新突变的鉴定

为了研究粘多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)患者发病的分子遗传学机制, 以便为今后的产前基因诊断等创造必要的前提条件, 文章先采用尿糖胺聚糖(GAGs)定性检测法对疑似MPSⅡ的先证者进行初诊, 然后采用PCR、PCR 产物直接测序法对先证者及其家系成员进行突变检测。在检出IDS基因c.876del2新突变后, 对随机采集的120例正常对照和其他非II型MPS患者包括MPSⅠ, Ⅳ, Ⅵ三型的病人共15例的IDS基因exon 6进行序列分析, 同时采用不同物种突变点序列的保守性分析法, 以及直接测定患儿及其家庭相关成员IDS酶活性的方法对该新突变进行致病性分析。结果显示: 先证者尿检呈强阳性(GAGs +++); 其IDS基因exon 6编码区内存在c.876-877 del TC新缺失突变, 为半合子突变, 而其母、其姐为杂合突变; 正常对照和其他非II型MPS患者的IDS基因exon 6的检测结果均未发现该突变; 不同物种氨基酸序列的同源性比对显示: c.876-877 del TC突变所在的位置即p.292-293的苯丙氨酸(F)谷氨酰胺(Q)高度保守; 酶活性测定的结果显示: 先证者的IDS酶活性仅为2.3 nmol/4 h/mL, 大大低于正常值, 而其父的为641.9 nmol/4 h/mL, 其母的血浆酶活性为95.8 nmol/ 4h/mL, 其姐的为103.2 nmol/4 h/mL。说明所发现的c.876-877 del TC缺失移码突变是一种新的病理性突变, 是该MPSⅡ患儿发病的根本内因。     

致歉和更正北大核心CSCD

因排版公司及我刊编辑工作疏忽,导致2017年11期乔龙亮、朱鹏和庞建虎的文章"II型硫脂酶与次生代谢产物合成(中国生物化学与分子生物学报,2017,33(11):1115-1124)"英文摘要误排,特向该文作者乔龙亮、朱鹏、庞建虎以及本刊读者表示深深的歉意。     

致歉和更正

正因排版公司及我刊编辑工作疏忽,导致2017年11期乔龙亮、朱鹏和庞建虎的文章"II型硫脂酶与次生代谢产物合成(中国生物化学与分子生物学报,2017,33(11):1115-1124)"英文摘要误排,特向该文作者乔龙亮、朱鹏、庞建虎以及本刊读者表示深深的歉意。     

一种适用于柱层析监测的己糖醛酸测定法

本文报道了一种改良的应用咔唑硫酸反应测定己糖醛酸方法。与Bitter和Muir法对比,本法操作简易,所需样品和试剂量少,而显色度高,适用于无自动分析设备条件下的柱层析监测和多份样品的测定。对应用本法测定己糖醛酸的最佳条件及干扰因素进行了探讨。     

海洋链霉菌酰基辅酶A硫酯酶基因的克隆及分析

酰基辅酶A硫酯酶(ACOT)是催化脂酰辅酶A水解成自由脂肪酸和辅酶A的一类酶,而II型ACOT对底物具有较高的特异性,在脂肪酸合成途径中起着重要的作用,II型ACOT的缺乏或失调会导致机体脂肪酸代谢的紊乱,从而引起一系列疾病。从海洋链霉菌L1基因组DNA中克隆到786碱基的ACOT II基因,生物信息学分析表明其拟编码262个氨基酸,与Acyl-CoA thioesterase II (sequence ID:WP 069742521.1)相似性达到100%。BLAST比对发现,其属于热狗超家族成员,并包含一个II型硫酯酶催化反应的特有结构域。并构建了表达载体pET32a-ACOT II,0.5 mmol/L IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE显示其分子量约为37.0 kD。通过对链霉菌中II型ACOT基因的研究,可为进一步深入研究II型硫酯酶的分子结构和生物学功能,进而指导药物研发提供参考。     

II型限制性核酸内切酶在真核生物染色体显带中的应用

限制性核酸内切酶（简称限制酶)能切割DNA双链。已知的限制酶有I, II和III型三类。II型限制酶能识别专一核普酸序列,并在识别序列内有固定切割点,是分子生物学研究和基因工程重要工具酶。1980年,以II型限制酶处理印度鹿染色体,沿染色体纵轴得到选择消化结果^[16]。目前,限制酶这一应用研究发展成称为限制性核酸内切酶显带（Restriction endonuclease banding）的最新显带技术,已应用于哺乳类、鸟类、两栖类、鱼类和昆虫等真核生物。限制酶显带与其他显带法相比有其特点,特别在揭示异染色质的异质性方面有其独到之处。本文介绍此项技术的发展与现状,并指出需要进一步探索的几个主要方面。     

不同成熟度菠萝贮藏特性的差异

随着菠萝果皮由绿转黄,果肉硬度及可溶性固形物含量降低,可溶性糖醛酸含量增加,多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性持续升高,而果胶脂酶(PE)活性在过熟期达到高峰并开始下降。研究表明,同一菠萝不同部位果肉硬度、PG活性及可溶性糖醛酸含量差异较大。     

人类高赖氨酸血症源于线粒体稳态破坏

氨基酸代谢紊乱是一类遗传性代谢病,绝大多数属于常染色体隐性遗传病。高赖氨酸血症即是其中一种比较罕见的氨基酸代谢病,分I型和II型。I型患者血液中赖氨酸浓度偏高,但是症状不明显。II型患者血液中除赖氨酸浓度升高外,酵母氨酸浓度也会增高,患者会表现出严重的神经损伤和发育迟缓,多数患者在成年之前死亡。目前的研究对人体内的赖氨酸主要降解途径——酵母氨酸途径已经比较清楚:双功能酶α-氨基半醛合酶(α-aminoadipic semialdehyde synthase,AASS)是该途径主要的催化酶.     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

羊栖菜褐藻糖胶抗凝血活性的研究

本文研究了羊栖菜褐藻糖胶的化学组成和抗凝血活性之间的关系。采用热水提取得羊栖菜粗多糖,CaCl2纯化得褐藻糖胶,DEAE Sepharose CL-6B柱层析与Sepharose CL-6B柱层析对褐藻糖胶进行分级,得到F1、F2、F31、F32和F33五个级分,均为岩藻糖、半乳糖和甘露糖等糖基组成的杂多糖,并含有硫酸酯和糖醛酸以及少量的蛋白质,相对分子质量范围2．5万～95万。采用活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)检测了这5个级分的抗凝血活性,结果显示,羊栖菜褐藻糖胶能显著延长APTT的凝血时间,而对TT的影响不明显。F1、F31和F32对APTT的影响比较显著,而F2、F33和羊栖菜粗多糖的影响较小。研究表明,羊栖菜褐藻糖胶主要是通过抑制内源凝血途径而达到抗凝血的效果,其抗凝血活性与褐藻糖胶的硫酸基含量成正相关,而与相对分子质量和糖醛酸含量无关。     

固定化内切型肝素酶的研究

将提纯的一种内切型肝素酶固定于聚酯载体上 ,固定化效率达 78 8%。酶活力在pH为 7 5左右时表现最高 ,并且在此条件下固定化酶的稳定性最好。最适反应温度为 4 0℃。热稳定性试验表明 ,固定化酶的稳定性较差。固定化酶的使用半衰期比游离酶延长 4 4倍。固定化酶催化肝素底物反应的Km 值约为 95 4 μmol L而游离酶的Km 值约为 71 2 μmol L。固定化酶可以同时作用于肝素和硫酸乙酰肝素 ,而对硫酸软骨素没有催化能力。肝素经降解后 ,产生一定量的非硫酸化或低硫酸化的二糖和不同聚合度的寡糖混合物。     

硒化紫球藻胞外多糖组成与结构的初步分析

通过在ASW培养基中加入适量的亚硒酸制备硒化紫球藻胞外多糖,经分离纯化、纯度鉴定后,利用下列手段对其进行分析:通过紫外可见光谱扫描、红外光谱扫描了解其结构信息;通过高效液相色谱对其单糖组分进行分析;通过硫酸-咔唑法测定其糖醛酸含量;通过硫酸比浊法测定其硫酸根含量,等。Se-PSP和PSP一样,分离后分别得到两种成分,紫外光谱也和PSP相似,不含有蛋白质和核酸;红外光谱显示Se-PSP中Se可能取代了C-H上的H和SO42-中的S;HPLC显示其单糖组分种类相似,含量稍有差别;另外,PSP和Se-PSP所含的糖醛酸含量没有统计学差异,Se-PSP所含SO42-比PSP少。     

新抗生素和糖尿病治疗药物开发的靶标——葡糖胺-6-磷酸合酶

葡糖胺-6-磷酸合酶催化氨基己糖代谢和细胞壁合成的第一步反应,即利用D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸,该途径的终产物N-乙酰葡糖胺是细菌和真菌细胞壁构建的基本成分.真菌、昆虫和甲壳类动物的几丁质,哺乳动物的糖蛋白和黏多糖都是通过N-乙酰葡塘胺最终合成的.葡糖胺-6-磷酸合酶是一个胰岛素调节酶,介导II型糖尿病的胰岛素抵抗.因此葡糖胺-6-磷酸合酶被认为是开发抗细菌、抗真菌、治疗II型糖尿病及其相关并发症等疾病的药物的分子靶标.     

海洋来源硫酸软骨素降解酶的研究进展

硫酸软骨素作为糖胺聚糖的一类,广泛分布于细胞膜表面及细胞基质中,参与了一系列生理和病理过程。硫酸软骨素的功能多样性与其结构多样性密切相关,而硫酸软骨素降解酶在硫酸软骨素/硫酸皮肤素构效关系研究中发挥了重要作用。该文结合笔者工作,全面阐述了目前商品化硫酸软骨素降解酶的种类、作用机制,以及近期在海洋细菌中发现和鉴定的硫酸软骨素降解酶。最后,对海洋来源硫酸软骨素降解酶进行了展望。