新型DNA疫苗的构建及其对小鼠保护作用的研究

目的：构建新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗,检测其激发小鼠产生免疫反应的能力。方法：RT-PCR鉴定单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗在COS-7细胞中的表达,ELISA检测血清中中和抗体水平,病毒攻击检测其保护效应。结果：DNA疫苗候选株pVAX-gD能在COS-7细胞中表达,激发小鼠产生高滴度中和抗体,有效保护小鼠免受致死量病毒的攻击。结论：构建的新型单纯疱疹DNA疫苗是一株很有希望的人用生殖器疱疹疫苗。     

猪戊型肝炎核酸疫苗的构建及在BAL B/C小鼠免疫效应

将含有kozak序列及BamH I的上游引物和带有终止密码子及EcoRV酶切位点的下游引物,以猪HEVDQ1 ORF2为模板,进行PCR。将扩增片段和pcDNA3.1质粒以BamH I/EcoRV进行双酶切后进行连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α,经测序证明该序列正确,命名为pcDQ1。进行pcDQ1质粒提取,以Vero细胞为表达细胞进行转染,以间接免疫荧光试验进行验证。以100μg/次/只剂量的pcDQ1对BAL B/C小鼠进行免疫以获取单因子血清。共免疫3次,采集血清,进行ELISA效价测定。结果表明,该核酸疫苗可以免疫使小鼠产生抗体。     

乙肝病毒DNA疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

构建含adr亚型HBV表面抗原基因的核酸疫苗 ,考察人白细胞介素II基因及重组白细胞介素II的免疫佐剂作用。用含有人白细胞介素II基因的真核表达质粒及基因重组白细胞介素II蛋白作为佐剂 ,将编码乙型肝炎病毒表面抗原的重组真核表达质粒 pVAX/HBS免疫BALB/C小鼠 (试验组 ) ,同时设置注射质粒pVAX的阴性对照组 ,并分别于第 2 ,4周后加强免疫各 1次。试验组在第 4周时开始有HBsAb产生 ,阴性对照组未测到HbsAb ,试验组和对照组均未检测到HBsAg。乙肝病毒DNA疫苗能引起小鼠特异性体液免疫应答 ,白细胞介素II的真核表达质粒的佐剂作用不明显 ,基因重组白细胞介素II蛋白具有提高小鼠对乙肝病毒核酸疫苗免疫应答水平的佐剂活性。     

H1亚型猪流感病毒HA基因DNA疫苗的构建及其对Balb/c小鼠的免疫效果评价

以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)猪流感病毒HA基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出HA基因,并将其克隆到pCI-neo真核表达载体中,成功构建重组表达质粒pCI-HA,瞬时转染vero E6和293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay ,IPMA)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, iIFA)和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）实验证明,HA基因能够在哺乳动物细胞中有效表达并具有良好的生物学活性。将重组质粒三次免疫8w雌性Balb/c小鼠后,ELISA试验和中和试验结果表明该重组质粒能够诱导小鼠产生较高的抗体滴度,并具有良好的中和活性。因此为H1亚型猪流感DNA疫苗的研究奠定了理论基础。     

蓖麻油微胶囊化及对鼠抗生育研究

以甲苯2,4-二异氰酸酯(TDI)和乙二醇为原料,采用界面聚合法对蓖麻油进行微胶囊化,制成蓖麻油微胶囊。通过正交试验、显微镜计数法、测微尺测量其微胶囊直径等方法来研究影响微胶囊大小、分布和包埋率的各种因素,寻求制备微胶囊的最佳工艺条件,并利用制得的蓖麻油微胶囊对昆明种小鼠进行抗生育实验。实验结果表明:优化后的蓖麻油包埋率达95%以上,其直径分布在4~120μm之间,平均20μm。蓖麻油微胶囊抗着床的有效率可达80%以上,其中200 mg/kg剂量组为100%。抗早孕的效果也可达73%以上,其中400 mg/kg组为100%。     

减毒麻疹活疫苗对小鼠的细胞遗传学效应

本文以C57BL/6J小鼠为材料,以骨髓细胞微核、染色体畸变和生殖细胞微核、染色体畸变为指标,对国产减毒麻疹活疫苗的遗传安全性进行评价。结果表明,麻疹疫苗可引起小鼠骨髓微核细胞率、染色体畸变率以及精细胞微核细胞率明显升高,与接种剂量和接种后的时间有关;生殖细胞染色体畸变和对照比无显著性差异。     

鼠巨细胞病毒 IE-1核酸疫苗和灭活疫苗联合免疫抗病毒感染的研究

巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）在人群中感染普遍,对婴幼儿及免疫低下人群中造成严重疾病,目前还没有针对该病毒的商品化疫苗。本研究以BALB/c小鼠为动物模型,探讨鼠巨细胞病毒（Murine cytomega-lovirus,MCMV）IE-1 DNA疫苗和MCMV灭活疫苗联合免疫抗MCMV感染的免疫保护效果。将编码IE-1基因的DNA疫苗（pIE-1）通过肌肉注射辅以电穿孔的方式对小鼠进行初免,再用全病毒灭活疫苗单独或者辅以MF59佐剂进行加强免疫,分别通过ELISA和ELISPOT方法检测到联合免疫策略在免疫组小鼠体内诱导了MC-MV特异性的抗体应答和CTL应答;免疫两周后用3＆#215;LD50致死剂量MCMV感染小鼠,疫苗对小鼠的免疫保护通过检测小鼠存活率、重要器官中的病毒滴度及体重丢失率来评价。结果显示,与单独免疫DNA疫苗或灭活疫苗相比,IE-1 DNA疫苗联合灭活疫苗组能同时在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫应答,并提供小鼠完全保护;而且MF59辅以灭活疫苗免疫小鼠能增强疫苗的免疫效果。     

Helminth Coinfection Does Not Affect Therapeutic Effect of a DNA Vaccine in Mice Harboring Tuberculosis

Background

Helminthiasis and tuberculosis (TB) coincide geographically and there is much interest in exploring how concurrent worm infections might alter immune responses against bacilli and might necessitate altered therapeutic approaches. A DNA vaccine that codifies heat shock protein Hsp65 from M. leprae (DNAhsp65) has been used in therapy during experimental tuberculosis. This study focused on the impact of the co-existence of worms and TB on the therapeutic effects of DNAhsp65.

Methodology/Principal Findings

Mice were infected with Toxocara canis or with Schistosoma mansoni, followed by coinfection with M. tuberculosis and treatment with DNAhsp65. While T. canis infection did not increase vulnerability to pulmonary TB, S. mansoni enhanced susceptibility to TB as shown by higher numbers of bacteria in the lungs and spleen, which was associated with an increase in Th2 and regulatory cytokines. However, in coinfected mice, the therapeutic effect of DNAhsp65 was not abrogated, as indicated by colony forming units and analysis of histopathological changes. In vitro studies indicated that Hsp65-specific IFN-γ production was correlated with vaccine-induced protection in coinfected mice. Moreover, in S. mansoni-coinfected mice, DNA treatment inhibited in vivo TGF-β and IL-10 production, which could be associated with long-term protection.

Conclusions/Significance

We have demonstrated that the therapeutic effects of DNAhsp65 in experimental TB infection are persistent in the presence of an unrelated Th2 immune response induced by helminth infections.     

IL-12对巨细胞病毒DNA疫苗免疫增强作用的研究

白介素12(interleukin 12,IL-12)主要和细胞免疫应答有关,是免疫过程中重要的调节因子。本研究探讨IL-12对编码巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)即刻早期基因IE1的DNA疫苗的免疫增强作用。将CMVIE1质粒DNA单独或与编码IL-12的质粒DNA共同免疫小鼠,然后用致死量病毒攻击小鼠。通过检测小鼠体内诱导的细胞免疫应答、小鼠的存活率、体重丢失率、器官中的病毒滴度等来评价IL-12对疫苗免疫的佐剂效果。结果显示,与单独疫苗免疫组相比,IE1 DNA联合IL-12 DNA免疫组能够在小鼠体内诱导更高的细胞免疫应答水平,同时能够降低器官中的病毒滴度,显著提高保护率,从而更好地抵抗病毒攻击。实验证明,IL-12能够作为巨细胞病毒IE1 DNA疫苗的佐剂,提高免疫保护效果。     

薄荷油对雄性小鼠的抗生育作用研究

目的探讨薄荷油对雄性小鼠的抗生育作用。方法将60只健康的雄性性成熟昆明小鼠随机分成3个试验组和1个对照组,各试验组小鼠灌胃0.135 g/(kg·d),0.27 g/(kg·d)和0.54 g/(kg·d)的薄荷油0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC)混悬液,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液,灌胃1周后按雌雄比2∶1合笼,继续对雄鼠灌胃至19 d,采集雄性小鼠的血液并测定血液生化指标,剖检灌胃雌雄小鼠,统计雌性小鼠的怀孕率,测定雄性小鼠睾丸与附睾的脏器系数及附睾精子活力,并固定睾丸和附睾,研究其组织学变化。结果与对照组相比较,雄性小鼠灌胃薄荷油后,导致雌性小鼠的怀孕率降低,睾丸脏器系数和附睾精子活率极显著降低(P<0.01),精子畸形率极显著升高(P<0.01)。光学显微镜下,试验组小鼠睾丸和附睾均有一定程度的损伤,睾丸间质减少,睾丸各级生精细胞排列疏松,曲细精管内有多核巨噬细胞浸润。附睾具正常的管腔结构,但能明显观察到管腔内精子减少。结论薄荷油对雄性小鼠具有抗生育作用,且主要通过影响精子的生成及破坏生精组织而达到,具有实际应用价值,可进一步开发成环境友好型鼠类抗生育药剂。     

蓖麻提取物对鼠抗生育作用的实验研究

利用蓖麻提取物对昆明种小鼠进行了短期与长期的抗生育实验,研究发现蓖麻提取物（蓖麻油和蓖麻蛋白）对小鼠有明显的抗生育作用。蓖麻蚩白及其与蓖麻油的混合物在抗早孕方面的效果均可达到100％,蓖麻油抗着床的效果也可达到100％。蓖麻油长期抗鼠生育效果明显,在210d（正常小鼠的妊娠期是21～23d）内有效降低小鼠生育代数与产仔数,生育抑制率达80％以上。蓖麻提取物对离体小鼠子宫的影响也非常显著,通过增强小鼠子宫内部收缩有效减少着床机率。在中止妊娠的实验中发现,服用了蓖麻蛋白及其与蓖麻油的混合物的小鼠子宫内没有着床位点。     

DNA疫苗及其在鱼类生产中的应用

近几年来,DNA疫苗以其高效、稳定等特点越来越受到各国研究者的重视,并在鱼类生产上做了很多试验研究,取得了一定的成果。就DNA疫苗的构建、作用原理、佐剂、接种方法、安全性、目前存在的问题及应用前景作一综述。     

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RTPCR方法扩增MAGE-3 cDNA,以pcDNA3.1+为载体,构建重组表达质粒pcDNA3-1/MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞,经RT-PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。以100μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠,间隔10天,共3次,以空载体和PBS为对照。结果,重组质粒免疫的小鼠,其脾淋巴细胞对MAGE-3阳性靶细胞的杀伤活性为51.08±7.41%,与空载体组（8.44±1.89%）及PBS组（5.76±1.75%）相比,差异有显著性（P<0.01）,而对MAGE-3阴性靶细胞的杀伤活性分别为8.21±1.65%,7.68±1.56%和5.13±1.42%,其差异无显著性;MAGE-3 DNA疫苗组免疫血清1∶15稀释时能检测到抗MAGE-3抗体,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2水平明显升高,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢,与对照组相比,差异显著（P<0.01）。说明MAGE-3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。     

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE 3重组质粒免疫小鼠可以诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答     

Ag85ADNA疫苗对荷瘤鼠Th1细胞免疫功能的影响

为了探讨肌肉注射Ag85A DNA疫苗能否在肿瘤宿主,一个低细胞免疫应答的机体内激发Th1型细胞免疫应答,将6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分成实验组(Ag85A-V1Jns.tPA组),空质粒组(V1Jns.tPA组)和生理盐水组3组,将生长旺盛的Meth-A细胞接种于各组小鼠右侧背部皮下,每只小鼠2×105个细胞,1d后于小鼠大腿肌肉内分别注射100μL Ag85A-V1Jns.tPA(1 g/L),V1Jns.tPA(1 g/L)或生理盐水。每10 d 1次,共3次,于末次注射后第8 d,无菌取脾,分离细胞进行培养。检测NK细胞活性以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量。结果显示:实验组平均NK细胞杀伤率以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量较空质粒组和生理盐水组均显著增高,而空质粒组和生理盐水组之间未见有意义的变化。提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗可以提高Meth-A纤维肉瘤荷瘤小鼠Th1细胞免疫功能。     

乙肝病毒RNA复制子疫苗与DNA疫苗对小鼠免疫效率的比较

为建立并获取更有效的乙肝疫苗,本实验通过将所构建的HBV RNA复制子疫苗和DNA疫苗分别免疫小鼠,检测细胞免疫与体液免疫的效果.结果表明,以pSFV为基础构建的疫苗载体免疫小鼠后采集的血清中抗体效价不随免疫剂量的增加而提高,在较低剂量免疫的时候,RNA复制子疫苗所产生的抗体效价优于DNA疫苗.并且RNA复制子疫苗在以较低剂量免疫后脾细胞CTL活性高于DNA疫苗.本研究证明HBV RNA疫苗比DNA疫苗表达效果更好,安全性更高,更具有应用前景.     

MPT63核酸疫苗的制备及其免疫原性

扩增结核分枝杆菌分泌蛋白MPT63编码序列 ,克隆于真核表达载体pJW 4 30 3中 .转染COS 7细胞 ,用Western印迹检测表明该基因在细胞内得到正确表达 .用该质粒连续免疫C5 7BL 6小鼠 3次后 ,用纯化的重组蛋白MPT63检测小鼠血清中的抗体 ,发现抗体滴度达到 10 5,免疫动物中γ干扰素的含量达到 2 5 8± 0 2U ml ,为空载体DNA免疫对照组的 2 0倍以上 ,说明MPT63核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答     

Antiangiogenic Tumor Therapy by DNA Vaccine Inducing Aquaporin-1-Specific CTL Based on Ubiquitin-Proteasome System in Mice

Aquaporin-1 (AQP-1) is a water channel protein highly expressed in the vascular endothelial cells of proliferating tissues including malignant cancers. Given that in APC ubiquitinated peptides are effectively introduced into proteasomes from which CD8 epitopes are excised, we fused ubiquitin with AQP-1 (pUB-AQP-1) to produce a DNA vaccine. In C57BL/6J mice immunized with pUB-AQP-1, the growth of B16F10 melanoma was profoundly inhibited. The antitumor effect of the pUB-AQP-1 DNA vaccine was largely mediated by CD8 T cells, which secrete IFN-γ, perforin, and granzyme-B in the presence of APCs transfected with pUB-AQP-1. AQP-1-specific CD8 T cells possessed cytotoxic activity both in vivo and in vitro. After tumor challenge, the microvessel density decreased and the ratio of total blood vessel area to tumor area was significantly reduced as compared with control mice, resulting in a dramatic suppression of tumor growth. The immunization effect was completely abrogated in immunoproteasome-deficient mice. Strikingly this pUB-AQP-1 DNA vaccine was also effective against Colon 26 colon tumors (BALB/c) and MBT/2 bladder tumors (C3H/HeN). Thus, this ubiquitin-conjugated DNA immunization-targeting tumor vasculature is a valid and promising antitumor therapy. This vaccine works across the barriers of tumor species and MHC class I differences in host mice.     

核酸疫苗双表达载体的构建及表达

将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXI载体多克隆位点,构建出核酸疫苗双表达载体pVI。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和新霉素磷酸转移酶(neor)基因作为报告基因,连接到pVI载体IRES基因的前后两处多克隆位点,构建出表达载体pEIN。通过脂质体介导的方法将该载体转染COS-7细胞,筛选到同时表达绿色荧光蛋白和新霉素磷酸转移酶的表达株,表明成功地构建了核酸疫苗双表达载体,为构建多价核酸疫苗及带有分子佐剂的核酸疫苗打下了基础。     

合欢皮总皂苷对雄性小鼠的抗生育作用研究

目的探讨合欢皮总皂苷对雄性小鼠的抗生育作用。方法将60只健康的雄性性成熟昆明小鼠随机分成3个试验组和1个对照组,各试验组小鼠灌胃540 mg·(kg·d)-1,270 mg·(kg·d)-1和135 mg·(kg·d)-1的合欢皮总皂苷水溶液,对照组自由饮水,灌胃1周后按雌雄比2∶1合笼,继续对雄鼠灌胃至19 d,采集雄性小鼠的血液并测定血液生化指标,剖检灌胃雌性小鼠,统计雌性小鼠的怀孕率,测定雄性小鼠睾丸与附睾的脏器系数及附睾精子活力,并固定睾丸和附睾,研究其组织学变化。结果与对照组相比较,雄性小鼠灌胃合欢皮总皂苷后,导致雌性小鼠的怀孕率降低,睾丸脏器系数和附睾精子活率极显著降低(P<0.01),精子畸形率极显著升高(P<0.01)。光学显微镜下,试验组小鼠睾丸和附睾均有一定程度的损失,睾丸生精细胞排列疏松,间质减少,可见曲细精管内有多核巨噬细胞浸润,各级生精细胞脱落。附睾具正常的管腔结构,但能明显观察到管腔内精子几乎消失。结论合欢皮总皂苷对雄性小鼠具有抗生育作用,主要通过影响精子的生成及破坏生精组织而达到。