藻类植物P450nor的生物信息学分析

氧化亚氮(N_2O)是一种重要温室气体,细菌、真菌、藻类和高等植物均可释放N_2O。细菌通过硝化与反硝化作用产生N_2O,真菌通过关键酶P450nor生成N_2O,但关于藻类和高等植物的N_2O产生机制迄今却鲜有报道。本研究以进化地位处于真菌和高等植物中间的藻类为对象,从Gen Bank中筛选出来自3种藻类(莱茵衣藻、胸状盘藻和小球藻)的3条P450nor蛋白相似序列并进行预测和分析,其功能预测结果显示,三者均为定位于线粒体中的可溶性非分泌型亲水性蛋白,具有Pfam P450保守结构域和3个保守motif,由此推测藻类P450nor具有较高的保守性;其进化分析结果表明,藻类与真菌P450nor具有较高同源关系。因此,推测藻类P450nor具有与真菌相似的生物学功能。由于藻类特殊的进化地位,这将为探究藻类与高等植物的N_2O产生机制及全球N_2O源汇不平衡提供科学依据和线索。     

真菌-氧化氮还原酶细胞色素P-450nor 2 cDNA序列的测定

在真菌的反硝化作用中,一种细胞色素P-450起着一氧化氮还原酶的作用,被称为细胞色素P-450nor^[1]。最近的研究发现：真菌细胞色素P-450nor有三种类型。除了缣孢菌(Fusarium oxysporum)P+450nor(即F．P-450nor)外。还有两种存在于柱孢菌(Cylindrocarpon tonkinense)．即C. P-450norl和2^[2]。 F．P-450nox和C．P-450norl能以NADH为直接的电子供体,使NO还原生成N₂O。C. P-450nor2不仅能直接利用NADH。而且能直接利用NADPH．还原NO生成N₂O。F. P-450nor基因已被克隆和测序^[3-4]。本文测定了C．P-450nor2的eDNA编码区全序列,3’非编码区部分序列和5’引导序列。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

真菌的反硝化作用与细胞色素P－450

真菌的反硝化作用与细胞色素Ｐ－４５０刘德立（华中师范大学生物系,武汉４３００７０）关键词反硝化作用,细胞色素Ｐ－４５０反硝化作用是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成Ｎ２或Ｎ２Ｏ的过程,是大气氮循环中的一部分。多种细菌具有反硝化能力。但近年来的研究证明：有些真菌...     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P-450nor的分离纯化

用DE－52纤维素柱色谱法和FPLC法（fastProteinliquidchromatography）分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌细胞色素P－450nor（recombinant　fusariumoxvsporumcytochromeP－450nor,rF．P－450nor）．经梯度洗脱MonoQ纯化后的rF．P－450nor为单一色谱峰,比活达55．20U／mg,纯化倍数约为1100倍,SDSPAGE检测为单一谱带．     

真菌一氧化氮还原酶细胞色素P—450nor 2 cDNA序列的测定

真菌一氧化氮还原酶细胞色素Ｐ４５０ｎｏｒ２ｃＤＮＡ序列的测定刘德立（华中师范大学生命科学学院武汉４３００７０）ＨｉｒｏｆｕｍｉＳＨＯＵＮ（筑波大学应用生物化学系日本）在真菌的反硝化作用中,一种细胞色素Ｐ４５０起着一氧化氮还原酶的作用,被称为细胞色...     

真菌对土壤N2O释放的贡献及其研究方法

N₂O是一种重要的温室气体,而土壤作为N₂O的重要来源之一,其N₂O主要产生于硝化和反硝化作用的生物过程.研究表明细菌和古菌是这些生物过程的主要参与者,然而在特定土壤生态系统中,真菌在N循环过程中起主要作用.但真菌对土壤N₂O释放贡献的研究报道甚少.本文阐述了土壤真菌N₂O产生机制的研究进展,介绍了自养硝化、异养硝化和反硝化过程的发生机理、关键微生物和功能基因.详细介绍了与真菌有关的N₂O产生过程,真菌的异养硝化作用和反硝化作用,并且比较了真菌和细菌反硝化系统的差异.此外,本文重点总结了研究土壤真菌N₂O产生的主要方法,包括选择抑制剂法、^15N标记、分离和纯培养以及免培养的分子生态学方法,对各种方法的优势和弊端进行了探讨,并对今后的研究工作提出了展望.     

真菌反硝化过程及其驱动的N2O产生机制研究进展

真菌反硝化过程的发现打破了反硝化过程只发生在原核生物中的传统认识,是对全球微生物氮循环过程的重要补充。真菌参与的反硝化过程由于缺乏N_2O还原酶,其终产物为具有强辐射效应的温室气体N_2O。真菌在环境中分布广泛,生物量巨大,故真菌反硝化作用对全球N_2O释放通量的贡献是不容忽视的。近年来许多研究表明,真菌反硝化过程是自然环境中N_2O产生的重要途径。本文对反硝化真菌的发现、多样性及分布、产生N_2O的机制和活性测定方法等几个方面进行综述,并对未来的研究提出展望。     

柱孢菌细胞色素P—450nor2cDNA克隆与表达

在真菌反硝化作用中,一种独特的细胞色素Ｐ－４５０起着一氧化氮还原酶的作用。用λｇｔｌｌ构建了柱孢菌ｃＤＮＡ文库。纯化的柱孢菌Ｃ．Ｐ－４５０ｎｏｒ２免疫兔,制备抗体。并用４抗体选出阳性克隆。