牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区的克隆及其功能检测

通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区序列,在线软件分析表明5'调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit-、RARE/TRE、AP4等转录因子结合位点.采用DNA重组的方法,将克隆得到的5'调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载体pEGFP-JFALP.重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间的延长而增强.结果 表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础.     

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的, 利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin 基因, 得到的β-actin 基因片段SZ21包含启动调控区, 大小为2 398 bp。SZ21的启动调控区包括β-actin 基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA 框和CArG 框等元件。对启动子序列在线分析表明, 获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子, 将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上, 构建成重组表达载体β2 pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明, 克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实, 克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性, 在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA, 均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)基因启动子及信号肽核苷酸顺序测定与解析

在pFOG405重组质粒中的大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)的启动子及信号肽区的核苷酸顺序被测定并同Kikuchi等人在pYK190重组质粒中所报道的顺序进行了比较。结果指出,包含有PhoA基因启动子及信号肽的PvuⅡ-HpaⅠ片段对于调控外源基因的表达是足够的;启动子5’-端的二元对称结构(26bp)的缺失并不影响外源基因的表达水平。由于pYK190及pFOG405中PhoA基因启动子的上游区核苷酸顺序的不同源性,说明此上游区顺序与PhoA启动子调控下的外源基因表达无关。这一分析为我们利用PvuⅡ-HpaⅡ片段组建高效分泌表达载体及研究基因表达调控提供了有用信息。     

斑马鱼心肌特异性启动子的克隆及其功能鉴定*

目的:探讨心室肌球蛋白重链(vmhc)基因启动子的心肌组织特异性.方法:利用PCR技术从斑马鱼基因组中克隆了vmhc编码区5’上游大小为1952bp的调控区域,应用酶切连接方法将vmhc启动子插入pGEFP-N1质粒,成功构建pEGFP-vmhc重组载体.再应用高保真DNA聚合酶PCR扩增包含vmhc启动子序列,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列及3'UTR序列的基因片段,经过纯化后通过显微注射将vmhc-EGFP基因片段导入斑马鱼受精卵中.结果:注射后的斑马鱼心脏中出现绿色荧光,而其他部位无荧光出现.结论:vmhc启动子能够正确有效地驱动外源基因在斑马鱼心脏中特异表达,适合应用于心血管疾病的基因功能研究,基因靶向治疗等.     

配体依赖性Cre重组酶在培养肝细胞中介导条件性基因激活

嵌合性Cre重组酶与肝组织特异性调控区的结合使其在肝细胞上介导的条件性基因激活成为可能。为此 ,首先构建了在小鼠白蛋白基因调控区调控下的Cre ERt表达载体 (Alb Cre ERt) ,然后将其构件分别转染工程化的BRL(大鼠肝细胞 )和BRK(大鼠肾细胞 )细胞株 ,这些细胞携带的floxed βgeo框架位于启动子与人碱性磷酸酶基因 (hAP)之间 ,因而阻碍hAP表达。用 1μmol/L 4 羟基三苯氧胺 (4 hydroxytamoxifen ,4 OHT)处理后 ,经碱性磷酸酶染色 ,部分BRL细胞显示碱性磷酸酶染色阳性 ;用PCR方法证实Cre重组酶介导了floxed βgeo框架的切除。然而 ,在未用 4 OHT处理的BRL细胞未观察到碱性磷酸酶染色阳性细胞 ,在用 4 OHT处理或未处理的BRK细胞同样未观察到碱性磷酸酶染色阳性细胞。这些结果表明已成功构建肝细胞特异表达Alb Cre ERt载体 ,并在表达Cre融合蛋白的BRL细胞证实 4 OHT能够诱导Cre介导的DNA重组 ,从而激活碱性磷酸酶报告基因的表达。该研究将为进一步建立肝细胞特异表达Cre ERt转基因小鼠奠定基础。     

人促红细胞生成素基因和GFP共表达的输卵管特异性表达载体的构建

本实验从蛋鸡输卵管基因组DNA中扩增出约1.3kb的卵清蛋白5＇端调控区（OV）,并从质粒扩增出人促红细胞生成素（hEPO）基因组DNA。将hEPO亚克隆入pEGFP-C1载体的多克隆位点,命名为pEGFP-hEPO,然后将OV片段亚克隆入经Ase I和Vsp I双酶切的切口处,替换掉CMV启动子,经测序和酶切鉴定正确,成功构建了鸡卵清蛋白5＇端调控区调控人促红细胞生成素的共表达载体pOV-GFP-hEPO。并利用脂质体转染法转染鸡输卵管上皮细胞,用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达,结果显示共表达载体pOV-GFP-hEPO能够在鸡输卵管上皮细胞定位表达。为制备生产人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。     

奶山羊β-乳球蛋白基因5＇、3＇调控区的克隆和序列分析

目的：克隆奶山羊β-乳球蛋白（BLG）基因5＇、3＇调控区,并对其进行序列分析。方法：从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到奶山羊BLG基因4.2kb的5＇调控区和1.8kb的3′调控区;将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性。结果：部分序列分析表明,奶山羊BLG基因5＇区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5＇区的同源性分别为100%和95%,3＇区的同源性分别为99%和93%;克隆得到的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同,二者5＇区和3＇区的同源性分别为83%和88%。结论：克隆得到的奶山羊BLG基因调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,用于外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达。     

人apoA-I分泌型表达调控细胞模型构建

分别从pMD18-T质粒和人基因组DNA扩增出人apoA-I CDS区序列和apoA-I启动子(702bp片段),与pEGFP-N1重组,构成受apoA-I启动子调控的pEGFP-N1质粒和融合蛋白表达质粒,分别转染人肝癌HepG2细胞,以绿色荧光为标志筛选稳定转染系列克隆。用RT-PCR、荧光显微镜、免疫荧光术等鉴定其中一个克隆融合蛋白的表达;分别以胰岛素和葡萄糖刺激物鉴定该克隆的外源apoA-I启动子调控。结果表明:人apoA-I分泌型表达调控肝细胞模型初步建成。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism