表达马铃薯X病毒和Y病毒双价外壳蛋白基因马铃薯植株的抗病性

表达马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）和马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＹ）双价外壳蛋白（ＣＰ）基因的马铃薯虎头和克新４号,用机械摩擦同时接种ＰＶＸ和ＰＶＹ后,通过症状观察,植株中ＰＶＸ和ＰＶＹ的ＥＬＩＳＡ检测结果表明,转基因头虎头和克新４号的多数株系的平均病毒含量均明显低于未转基因的对照植株,不同时期病毒测定结果表明,许多株系病毒积累缓慢,延迟发病,说明转ＰＶＸ,ＰＶＹ双价ＣＰ基因的马铃薯,对ＰＶＸ和ＰＶＹ复合侵染发生不     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因在转基因烟草植株中的表达及抗病

通过根癌农杆菌介导的叶盘法,将马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因导入烟草细胞并获得大量再生的转基因烟草植株。经胭脂碱检测、酶联免疫分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,证明已获得了具有马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因表达的转基因烟草。用２μｇ／ｍｌ的ＰＶＸ磨擦接种烟草,８天后进行观察,发现对照植株开始发病,而转基因烟草植株在２０后才开始发病,有的转基因烟草植株在整个生长期中都不得病。对ＰＶＸＣＰ基因表达量较高的４株植     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒 (PotatovirusS ,PVS)外壳蛋白 (CP)基因序列 (885bp)设计合成了两对引物 ,通过RT PCR扩增得到长 0 .8kb的目的片段 ,将目的片段转入大肠杆菌 ,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子 ,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较 ,发现其核苷酸同源性达 95 %左右 ;构建了含PVSCP基因的融合蛋白原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到表达 ,SDS PAGE测定融合蛋白的分子量为 5 8kD。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)外壳蛋白(CP)基因序列(885bp)设计合成了两对 引物,通过RT-PCR扩增得到长0.8kb的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明 得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较,发现其核苷酸同源性达95%左右;构建了含PVS CP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定融合蛋白的分子量为58kD.     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白的转基因烟草的抗病性研究

将马铃薯Ｙ病毒中国分离物（ＰＶＴ－Ｃ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因,在土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４的介导下,转化烟草生产品种ＮＣ８９,获得了６个烟草株系。通过抗性分析发现,６个株系中有一个株系在２００μｇ／ｍｌＰＶＹ－Ｃ的攻毒下,仍未发病,分子检测发现,转基因植物中抗性产生的程度并不是同ＰＶＹ－Ｃ外壳蛋白的表达水平成正相关。     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Ｙ病毒普通系（ＰＶＹ０）的外壳蛋白基因克隆到表达质粒ｐＭＡＬｃ２中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体ｐＭＡＬｃ２ＰＶＹ０ＣＰ。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明,这一表达栽体在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中经ＩＰＴＧ诱导可表达分子量为７１．８ｋＤａ的特异性融合蛋白。以ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为１∶１０２４的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对ＰＶＹ进行检测     

马铃薯X病毒分子生物学研究进展及其作为表达载体的应用

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)又称马铃薯潜隐病毒(Potato latent virus)或马铃薯轻花叶病毒(Potato mild mosaic virus),是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的模式成员,遍布于全世界马铃薯种植区.受侵染叶片呈花叶症状,田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产.     

Resistance to Potato Virus X Infection in Transgenic Tobacco Plants with Coat Protein Gene of Virus

A major commercial cultivar of tobacco was transformed via Agrobacterium mediated procedure. Tobacco leaves started to form shoots on shoot inducing medium containing kanamycin after infected by Agrobacterium containing the plasmid with PVX CP gene. Regenerated plants were obtained in two weeks on hormone-free MS medium containing kanamycin. The transgenic tobacco plants were identified with nopaline detection,enzyme-linked immunosorbent assay and western blot analysis, symptom appearance was significantly delayed and virus accumulation was either absent or reduced in PVX CP gene transformed plants. Progenies of transgenic tobacco plants also gained resistance to PVX infection to a certain degree. These experiments demonstrate that CP protection is effective against PVX.     

Expression of Potato Virus Y Coat Protein Gene in Transgenic Potato

Potato virus Y (PVY) N coat protein (CP) coding sequence was cloned into a plant expression vector pMON316 under the CaMV 35S promoter. Leaf discs of potato (Solanum tuberosum) were used to Agrobacterium-mediated gene transfer. A large number of regenerated putative transgenic plants were obtained based on kanamycin resistance. Using total DNA purified from transgenic plants as templates and two oligonucleotides synthesized from 5' and 3' of the PVY coat protein gene as primers, the authors carried out polymerase chain reaction (PCR) to check the presence of this gene and obtained a 0. 8 kb specific DNA fragment after 35 cycles of amplification. Southern blot indicated that the PCR product was indeed PVY CP gene which had been integrated into the potato genome. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of our transgenic plants showed that CP gene was expressed in at least some transgenic potato plants.     

黄瓜花叶病毒CP基因原核表达及抗血清的制备

把黄瓜花叶病毒 (CMV)西番莲分离物的外壳蛋白 (CP)基因 ,通过BamHI SacI位点定向插入pET 2 2b( )载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导下 37℃培养 6h ,SDS PAGE电泳示表达蛋白分子质量为 31 8kDa ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 9%,表明该蛋白得到了高效表达。用冰冷的氯化钾溶液显色 ,用表达的特异蛋白质条带制备抗原 ,免疫家兔制备出病毒特异抗血清。采用ID ELISA测定抗血清效价为 1 0 -6;抗血清和CMV几个分离物均有特异反应 ,和TMV、菌体蛋白不发生非特异性反应 ;检测病毒灵敏度达 30ng ml,能够从稀释 31 2 5倍的感病植物汁液中检测出病毒     

应用核酶体外切割马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的研究

针对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因第356～358位点“GUC”．设计、合成了一种“锤头状”核酶。将核酶基因克隆在体外转录载体PSPT19的SP6启动子下游;同时将PLRVCPcDNA亚克隆在体外转录载体pSPT18的SP6启动子下游。利用SP6RNA聚合酶分别体外转录,获得核酶分子和靶RNA序列。在41℃保温进行核酶切割反应,检测到预期大小且被切开的两个RNA短片段。     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的合成,分子克隆和全序列分析

以分离自马铃薯主栽品种“紫花白”的马铃薯卷叶病毒(PLRV)分离物的RNA为模板,用人工合成的引物,用反转录和随后PCR扩增的方法合成了PLRV外壳蛋白(CP)基因的cDNA,并克隆于pUC19中。进一步用限制酶切和核苷酸序列分析表明,合成的cDNA由627个核苷酸组成(包括起始和终止密码),序列中有Hinc Ⅱ和BamH Ⅰ两个酶切位点,与国外报道一致。和国外的4个PLRV分离物CP基因序列对比结果,具有高度同源性,其同源率达99.0—99.7％。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT-PCR扩增得到长约1500bp的目的片段。将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了含TRSVcp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP。序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%~94.6%。将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的TRSVCP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa。以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应。     

番木瓜环斑病毒YsCP基因的序列分析和植物表达载体的构建

用双脱氧链终止法分析了克隆的番木瓜环斑病毒（PRV）Ys株系外壳蛋白（CP）基因的序列,结果表明YsCP基因全长858nt。对PRV国内外16个株系或分离物CP基因的比较发现,YsCP基因与国内株系或分离物CP基因的同源性较高（94．44％～97．68％）,而与国外株系或分离物CP基因的同源性较低（88．88％～92．70％）。CP基因之间的差异主要靠近基因5’端,特别是在YSCP基因第63nt后连续缺失6nt,SmGTHAI和SRI的CP基因也在此处缺失3nt。将YsCP基因插入中间质粒pRokⅡ的CaMV35S启动于和nos终止序列之间形成CP基因的植物表达载体pRPCY,通过三亲交配使pRPCY进入农杆菌LBA4404,与其中的pAL4404构成双元载体系统。