CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础.     

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。     

盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因表达及甜菜碱含量的变化

利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和雷氏盐紫外分光光度计法分别测定了400mmol/L NaCl胁迫处理0,0.5h,2h,12h,1d,2d,4d,6d,8d,10d和12d,甘菊叶片中BADH基因表达和甜菜碱含量的变化,并讨论了二者间的相互作用关系。试验结果表明,在高盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因和甜菜碱含量均呈现先上升后下降的趋势。在处理初期(0.5h和2h)BADH基因的表达量与对照相比略有下降,此后随处理时间的增加BADH基因表达持续增大,在胁迫处理6d时BADH基因表达量最大为对照的4.6倍,6d之后BADH基因表达量逐渐降低。甜菜碱含量在NaCl处理0.5h突然增大以应对胁迫反应,此后其含量出现了小幅的震荡上升,在胁迫处理4d时达到了最大值,此后随胁迫处理时间的增加甜菜碱含量逐渐降低。二者之间的变化并不是同步的,而是存在滞后性,分析认为甘菊叶片中BADH基因表达与甜菜碱积累间存在相互抑制的作用。     

甘菊CMO同源基因的分离与表达分析

利用半嵌套巢式PCR结合RACE技术从菊科植物甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.)Makino]中分离得到了一个长度为1 450 bp的片段.序列分析结果表明,其开放阅读框全长1 140bp,编码379个氨基酸残基;在GenBank 比对并进行系统进化分析可知,该片段为CMO同源基因,命名为ClCMO.利用不同胁迫处理进行分析发现,在非胁迫条件下ClCMO基因在甘萄茎、叶、花叶中均有表达信号,在根中没有表达;其可以响应干旱、高盐胁迫和脱落酸(ABA)的诱导,不响应冷热胁迫,并且其表达在水杨酸(SA)诱导下受抑制.这些结果表明,ClCMO基因是提高植物耐干旱、高盐能力的有效基因资源.     

盐胁迫下三色苋甜菜碱及有关酶含量的变化

三色苋(Amaranthus tricolor)不同器官中的甜菜碱(GB)含量显著不同.除子叶外,根、茎和叶的GB含量和茎、叶中的胆碱单加氧酶(CMO)含量都因300 mmol/L的NaCl处理而增加.甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的表达无论盐处理与否在所有器官中都能检测到,其含量变化不大.当种子发芽时,具备合成GB的能力,CMO含量增加;在此之前未能检测到CMO,也不能合成GB.研究结果表明三色苋响应盐胁迫而合成GB的关键酶是CMO.     

抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus retrojflexus agglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白.把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功.将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株.     

OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究

OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子,与水稻耐寒性相关.以pCAMBIA3300为母体,利用玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了能使OsbHLH1基因过表达且含有Bar基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω- OsbHLH1.利用基因枪法将其转化到粳稻品种东稻3号中,获得再生苗47株.选取其中9株进行PCR、Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在水稻植株中正常表达;低温处理后,除45号植株外,其余8株光合速率的变化率显著低于非转基因对照,初步证明OsbHLH1基因在水稻中过表达显著提高了水稻的耐低温能力.     

双基因表达载体的构建及生物活性观察

为了促进肠上皮细胞增殖、加速肠上皮机械屏障修复和防止肠源性感染的发生,利用分子克隆技术首先获得含胰高血糖素样肽-2(GLP-2)编码序列的高血糖素原cDNA片段,通过PCR重叠延伸技术成功拼接GLP2的信号肤及成熟肽,同时将成熟肽N-末端第二位丙氨酸的序列(GCT)定点突变为GGT序列(甘氨酸);并以我室保存的pcDNA3.1-HD-5-cDNA为模板克隆防御素-5(HD-5)信号肽及成熟肽序列,分别构建到双基因表达载体pVITRO3,转染肠上皮细胞并观察其对肠上皮细胞增殖活性和杀菌能力的影响,结果显示构建的pVITR03-HD-5-GLP2双基因性表达栽体具有促进肠上皮细胞增殖和抑制细菌增殖和黏附的作用.     

几丁质酶基因表达载体构建及转化烟草的研究

构建了一个含有多个调控序列的带有几丁质酶基因的植物表达载体,通过发根农杆菌的Ri质粒介导转化烟草的三个品种：K326,RG11,VA116,在卡那霉素抗性培养基上筛选,获得了7株再生植株,以PCR检测、DNA斑点杂交证明表达载体构建成功,几丁质酶基因导入烟草并整合到烟草基因组中。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105.采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响.结果表明,选择无菌苗苗龄15 d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3-0.6,侵染时间8 min,侵染时菌体重悬液中添加50 μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3 d,抗性芽的获得率最高.对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性.     

甜菜碱与植物耐盐基因工程

向非甜菜碱积累植物导入甜菜碱合成途径是提高植物耐盐性的策略之一。甜菜碱是一种无毒的有机小分子化合物。盐胁迫下 ,它能在植物细胞中迅速积累以维持细胞的渗透平衡 ,并对胞内的一些重要酶类起保护作用。编码甜菜碱合成酶的基因已被克隆 ,并应用于植物耐盐基因工程。本文介绍了甜菜碱的生理作用、合成酶及相关基因的特性 ,并结合本实验室的工作对甜菜碱基因工程及其进展作了简单的综述     

人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin,根据大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并构建了hepcidin的融合表达载体pET -hpc。pET- hpc在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有 6个组氨酸。通过优化诱导表达条件,该融合蛋白表达水平显著提高,占总蛋白的 2 5 . 2 %。表达的包涵体经 1 %TritonX 1 0 0洗涤后溶于8mol L尿素,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化,所得融合蛋白纯度大于 95 %。     

三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达

在克隆得到三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)cDNA的基础上,构建原核表达载体pET32a(+)/FPS,并转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下,诱导表达FPS融合蛋白,对诱导表达条件进行了优化.结果表明:成功构建了原核表达载体pET32a(+)/FPS,并在大肠杆菌中成功表达FPS蛋白,分子量约为40 kD,为进一步开展FPS的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

aiiA基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA,采用电转化方法转入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5%甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的:构建人DC-SIGN基因真核表达质粒,观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达.为进一步研究DC-SIGN的作用奠定实验基础.方法:用PCR的方法扩增编码DC-SIGN的基因序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA中,酶切及测序鉴定重组质粒.将构建的重组质粒转染到A549细胞中,用Western Blotting和免疫荧光等方法检测DC-SIGN基因的表达.结果: 从人cDNA文库中得到1 215bp的DC-SIGN序列后,重组到pCDNA载体中,经酶切及测序鉴定,成功构建pCDNA-DC-SIGN重组质粒.重组质粒转染A549细胞,经Western blotting检测,发现在约55kDa处有特异条带,与理论大小相符.应用免疫荧光技术检测DC-SIGN可在A549细胞内的表达.荧光显示Myf5蛋白定位在细胞浆中.建立表达DC-SIGN的细胞株.结论:成功构建了人DC-SIGN的真核表达载体,并建立了人DC-SIGN的真核表达细胞株.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.