化学合成ω-芋螺毒素MⅦA的复性与质谱分析

为了探讨质谱分析在合成多肽氧化复性和分离纯化研究中的应用,用固相多肽合成方法合成ω－芋螺毒素MⅦA,在含谷胱甘肽的缓冲体系中进行氧化复性后,经离子交换和RP－HPLC分离纯化。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）和电喷雾串联质谱（ESI－MS／MS）分析ω－芋螺毒素MⅦA氧化复性和分离纯化的效果,最后用电生理学实验测定复性ω－芋螺毒素MⅦA的生理活性。其结果表明,获得的ω－芋螺毒纱MⅦA纯化复性样品具有与天然ω－芋螺毒素MⅦ完全相同的空间构象和生理活性。     

中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

M-超家族芋螺毒素研究进展

芋螺毒素是来源于芋螺毒液的活性多肽,具有分子质量小,作用靶点广泛且特异性高的优点,是一种丰富的生物资源。M-超家族芋螺毒素是芋螺毒素中较为复杂的超家族之一,包括μ-、ψ-和κM-家族,分别作用于电压门控钠通道、N型乙酰胆碱受体和电压门控钾通道。另外,mr3a和tx3c的发现预示M-超家族可能存在新的家族。本文对这些芋螺毒素的生理学和药理学特征、结构与功能的关系及应用研究进行综述。     

作用于烟碱乙酰胆碱受体的α~*-芋螺毒素研究进展

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTx)是由热带海洋中的肉食性软体动物芋螺分泌产生的一大类生物活性肽,它们相对分子质量小,能特异地作用于动物体内各种离子通道和受体,具有巨大的药物开发价值。其中,A-超家族的α-芋螺毒素(α-CTx)是发现最早的且最重要的一类成员,它能特异性作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs),是肌肉或神经型nAChRs的选择性阻断剂。nAChRs与中枢神经系统紊乱如疼痛、成瘾、癌症等多种疾病密切相关。近年来,人们陆续发现其他超家族的芋螺毒素中也有成员可阻断nAChRs,如αA-、αB-、αO-、αC-、αD-、αS-等家族的芋螺毒素。上述能阻断nAChRs的芋螺毒素统称为α~*-芋螺毒素(α~*-CTx)。α~*-芋螺毒素对nAChRs阻断活性的差别与它们的结构有着密切的联系。结合国内外研究现状,对α~*-CTx与nAChRs相互作用的关键位点以及结构与功能的关系进行综述,可为相关研究提供参考。     

2种新型ω-芋螺毒素的合成及作用靶点鉴定

目的:合成2个来自泡芋螺的新型ω-芋螺毒素Bu1、Bu13,测定其作用靶标,为研制新型镇痛药提供先导化合物。方法:固相合成线性肽,然后在折叠液(0.5 mol/L乙酸铵、1 mmol/L谷胱甘肽、0.1 mmol/L氧化谷胱甘肽)中于4℃折叠24～48 h,富集纯化得目标肽;利用膜片钳技术,测定其对N、P/Q及L型钙离子通道的抑制活性。结果:Bu1、Bu13对N型钙离子通道的半抑制浓度(IC50)分别为0.86、1.02μmol/L,抑制作用低于MⅦA(IC50=0.21μmol/L);10μmol/L Bu1、Bu13对P/Q型钙离子通道的抑制率分别为17.05%±1.34%、13.1%±2.69%,稍高于MⅦA(8.92%±2.12%);10μmol/L Bu1、Bu13对L型钙离子通道的抑制率分别为19.31%±6.22%、4.78%±0.77%,高于MⅦA(<5%)。结论:Bu1、Bu13选择性作用于N型钙离子通道,对P/Q、L型钙离子通道的抑制作用较低。     

芋螺毒素MrIA的串联表达、纯化及生物活性鉴定

芋螺毒素(Conotoxins,CTxs)是一类特异作用于离子通道和膜受体的小分子多肽,是研究受体结构和功能及其相关疾病的重要工具。MrIA是进入临床研究可用于镇痛治疗的一种T超家族的芋螺毒素。传统获取芋螺毒素是通过化学合成的方法,成本高、产量低。实验利用串联表达技术,构建原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中成功表达了芋螺毒素MrIA(recombinant MrIA,rMrIA)。通过溴化氰切割和纯化,最终1L菌液可获得纯度高达95%的rMrIA 30mg。小鼠热板实验表明,rMrIA具有较好的镇痛活性。这为大量获得MrIA以及其他芋螺毒素小肽的表达提供了方法。     

芋螺毒素基因资源研究进展

芋螺毒素和微生物的次生代谢产物与植物的生物碱一样,具有生物多样性的特点。芋螺毒素特有的二硫键骨架和化学修饰后特异的空间结构,使其具有特异的稳定性和药理学活性。对芋螺毒素基因的分析和新型基因的克隆筛选,是深入研究各种受体、离子通道及其亚型,进而在克隆表达的靶受体上设计和筛选高效新药的前提。芋螺毒素基因资源的研究在芋螺毒素新基因及其编码产物毒素肽的发现与利用方面发挥了重要作用。现对该领域的新进展进行论述。     

重组芋螺毒素GeXIVAWT的表达、纯化和鉴定

芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽.通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化.利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径.通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT.融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达.利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素.复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定.活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础.     

α-芋螺毒素的研究现状

α-芋螺毒素是近年来研究较多的一种海洋生物神经毒素,它特异性竞争结合烟碱型乙酰胆碱受体,化学结构独特。本文介绍了有关α-芋螺毒素的种类、结构特征、生物学活性和制备方法等方面的研究进展,及其在生物化学、生物学以及新药开发等方面的应用前景。     

μ-芋螺毒素——高特异性钠通道阻滞剂

μ-芋螺毒素是一类具有独特药理活性的海洋生物毒素,至今共发现有7种,均为16～22个氨基酸大小的小肽,其分子内部形成3对二硫键。它们高度特异性地阻断电压门控Na 通道,甚至能够区分Na 通道的不同亚型。最近发现的两种μ-芋螺毒素的特异性更强,可以选择性地作用于TTX-R型Na 通道,而对TTX-S型Na 通道几乎无任何影响,这种作用的特点对于研究Na 通道亚型及新药开发具有重要价值。     

芋螺毒素ImI的化学合成及其杀虫活性研究

为研究芋螺毒素Im I的杀虫活性,本研究采用化学方法合成芋螺毒素线性肽,经氧化折叠后质谱鉴定获得芋螺毒素Im I,采用MTT法和昆虫注射法研究其杀虫活性。结果表明采用化学合成法可以成功合成芋螺毒素线性肽,经氧化折叠后质谱鉴定形成2个二硫键;活性实验表明芋螺毒素Im I具有抑制昆虫细胞sf9生长的活性,半数有效量为0. 13 n M;对黄粉虫具有杀虫活性,半数致死剂量为0. 11μg/mg。通过化学合成法可以有效合成芋螺毒素Im I,其具有良好的杀虫活性,可为研发新型多肽类生物杀虫剂奠定基础。     

特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α*-芋螺毒素的研究

国际上被誉为"海洋药物宝库"的芋螺毒素(CTx),具有特异结合动物体内各种离子通道和受体的特殊功能。其中的α*-芋螺毒素(α*-CTxs)能特异性地作用于乙酰胆碱受体(n ACh Rs),对其亚型具有极高的选择性阻断活性。不同的亚基组合形成的各种乙酰胆碱受体亚型,在正常健康状态下和多种疾病状态下起着很重要的生理和病理学功能,这些功能至今尚不很清楚,因而发现和开发各种亚型的选择性分子探针,如α*-CTxs将有助于阐释各个亚型的精细结构和功能。深入研究特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的α*-CTxs的结构与功能,及其与受体相互作用的机理具有很重要的科学意义,将有助于研发出与n ACh Rs相关的多种疑难杂症的治疗药物,包括神经痛、癌症化疗、成瘾、痴呆、重症肌无力、精神分裂症、癫痫、乳腺癌、肺癌、脑脊髓炎,以及其他神经疾病等。近年来,我们实验室经过大量筛选研究,鉴定出5个海南产新颖α*-芋螺毒素,对它们的人工合成、三维结构、作用靶点、与受体相互作用机制、药理药效等进行了深入的研究。现对上述特异阻断乙酰胆碱受体不同亚型的5个海南产α*-芋螺毒素的研究进展和应用前景进行综述。     

α-芋螺毒素与乙酰胆碱结合蛋白共结晶的结构特点

烟碱型乙酰胆碱受体(n AChRs)是配体门控离子通道,它与疼痛、阿尔茨海默氏病、成瘾等疾病密切相关。α-芋螺毒素是n AChRs的拮抗剂,也是治疗上述疾病的先导药物。乙酰胆碱结合蛋白(ACh BPs)与n AChRs的配体结合结构域同源性较高,它们的药理特性和离子通道激活机制也相类似,α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构解析了α-芋螺毒素残基如何选择结合n AChRs。现对α-芋螺毒素与ACh BPs共结晶结构进行综述,旨在剖析α-芋螺毒素与n AChRs相互作用的关键残基,为开发药效更好的芋螺毒素提供参考依据。     

芋螺毒素的翻译后修饰

芋螺毒素是一类由芋螺毒液管分泌的生物活性小肽,能特异地作用于各种离子通道和神经递质受体.芋螺毒素的一个显著特点是具有高度的翻译后修饰,包括Glu的γ羧基化、L型氨基酸到D型氨基酸的异构化、Pro等的羟基化、Trp的溴代等.这些翻译后修饰在提高芋螺毒素分子多样性的同时,也增强了芋螺毒素的功能.现主要针对芋螺毒素中的各种翻译后修饰的发现、分布、功能和参与反应的酶系统进行综述.     

一种新4/3型α-芋螺毒素突变体的合成及功能研究

目的：合成难溶的新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］,并初步测定其与烟碱型乙酰胆碱受体亚型的结合作用。方法：采用Fmoc-固相法合成线性肽Eb1.3［ΔR1,W13M］,通过空气氧化折叠和磺化产物折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式,双电极电压钳技术检测其药理活性。结果：Eb1.3［ΔR1,W13M］线性肽经折叠生成的主产物Ⅰ的二硫键排列方式为少见的C1-C4、C2-C3,而非典型的C1-C3、C2-C4,线性肽磺化后再经GSH交换可加速折叠,10 μmol/L的产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型的抑制率为28.97%±8.44%。结论：新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］形成非典型的二硫键C1-C4、C2-C3,产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型具有一定的结合活性。     

新型α-芋螺毒素Di1.1的克隆、合成及功能研究

目的：从中国南海长距芋螺中克隆出新的芋螺毒素序列并用固相方法合成该毒素,测定其折叠后的二硫键配对方式并初步研究其药理学特性。方法：根据芋螺毒素A超家族保守的信号肽序列设计引物,通过3＇-RACE扩增,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因;采用Fmoc-固相法合成线性多肽,通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式;用双电极电压钳技术初步研究其药理学特性。结果：发现-种新的α-芋螺毒素Dil．1的cDNA序列,其成熟肽序列为CcVIESCHSNHIDECES;该肽二硫键连接方式以C1-C4、C2-C3为主,以C1-C3、C2-C4连接为辅,对烟碱型乙酰胆碱受体各亚型活性较弱。结论：Dil．1是-种新的α4／7型芋螺毒素,其折叠方式以C1-C4、C2-C3连接为主。     

新芋螺毒素基因的克隆及其遗传进化分析

全世界有约800种芋螺,每种芋螺产生多达2 000种的肽类毒素,这些毒素可以作用于电压门控离子通道(Na+,K+,Ca2+)、配体门控离子通道(n ACh Rs,5-HT3R,NMDAR)、G蛋白偶联受体(神经降压素和血管加压素)和神经递质转运蛋白。虽然已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、c DNA克隆和转录组测序获得,但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。A-超家族中α-芋螺毒素基因结构包含了一个内含子和被该内含子分开的两个外显子,成熟肽具有标准的4个半胱氨酸骨架(CC-C-C)。本研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列,采用多个PCR退火温度,从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架(CC-C-C-CC)的M-超家族芋螺毒素基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架(CC-C-C-C)的未知新家族芋螺毒素,并对它们的基因结构、成熟肽序列,以及与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。首次证实保守的α-芋螺毒素基因内含子序列可能存在于其他超家族中。     

海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热 带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内 氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦 电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺（Conus betulinus Linnaeus）毒管中分离 纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度 的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法. 以芋螺毒素线性 肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412 的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连 接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁 多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.     

Ⅰ-超家族芋螺毒素研究进展

Ⅰ-超家族芋螺毒素是芋螺毒素中较复杂的超家族之一,它可分为Ⅰ1和Ⅰ2两组．通常由33～46个氨基酸所组成．具有相同的4对半胱氨酸骨架,可特异性作用于各种离子通道及受体．现对该芋螺毒素的生物化学及分子生物学特征、生理学活性、结构与功能的关系及应用前景等方面的研究进行综述．     

织锦芋螺毒素的研究进展

芋螺毒素是来源于芋螺的毒液的活性多肽,由于其分子质量小、结构多样、作用靶点广泛、功能专一、组织特异性强等优点,广泛地被用作细胞中各种具有重要生理功能靶点的探针,以及作为新药的先导化合物甚至直接作为新药开发.芋螺可以分为食鱼、食软体动物和食虫3种类型,织锦芋螺是一种分布广泛的食软体动物芋螺.作为毒性最强的芋螺品种之一,织锦芋螺毒素成为食软体动物类芋螺毒素研究的代表.现对20世纪90年代末至今的织锦芋螺毒素方面的研究进行了综述.